S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Úvod
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - pôvodca neskorej plesne, ekonomicky najdôležitejšej choroby zemiakov a paradajok - priťahuje už viac ako sto a pol roka pozornosť výskumníkov z rôznych krajín. Náhle sa v Európe objavil v polovici XNUMX. storočia a spôsobil zemiakovú epidémiu, ktorá zostala v pamäti mnohých generácií.
Doteraz sa jej často hovorí „huba írskeho hladu“. Takmer sto rokov po prvých epidémiách boli objavené divoké mexické druhy zemiakov rezistentné proti neskorej plesni, boli vyvinuté spôsoby ich kríženia s kultivovanými zemiakmi (Muller, 1935) a boli získané prvé odrody odolné voči neskorej plesni (Pushkarev, 1937). Avšak krátko po začiatku ich komerčného pestovania sa hromadili rasy patogénu neskorej plesne, ktoré boli virulentné voči rezistentným odrodám. a zavedenie nových génov rezistencie z divých mexických zemiakov do odrôd začalo rýchlo strácať účinnosť.
Zlyhania pri použití monogénneho (vertikálneho) odporu prinútili chovateľov hľadať zložitejšie spôsoby využitia nešpecifického polygénneho (horizontálneho) odporu. V posledných rokoch sa v jednotlivých populáciách parazita začali hromadiť vysoko agresívne rasy, ktoré spôsobovali eróziu dokonca nešpecifického odporu. Príchod kmeňov rezistentných na fungicídy spôsobil problémy pri používaní chemikálií na ochranu zemiakov.
Kvôli významným rozdielom medzi oomycetami a hubami v chemickom zložení, ultraštruktúre a metabolizme sú fungicídy, najmä systémové, používané na ochranu rastlín pred mnohými plesňovými chorobami proti oomycetám neúčinné.
Preto sa pri chemickej ochrane proti neskorej plesni používalo viacnásobné (až 12-krát za sezónu alebo viac) postrek kontaktnými látkami širokého spektra účinku. Revolučným krokom bolo použitie fenylamidov, ktoré sú toxické pre oomycety a šíria sa systémovo v rastlinách. Ich rozsiahle použitie však rýchlo viedlo k akumulácii rezistentných kmeňov v populáciách húb (Davidse et al., 1981), čo významne skomplikovalo ochranu rastlín. P. infestans je prakticky jediným parazitom mierneho pásma, ktorého poškodenie v ekologickom poľnohospodárstve nemožno neutralizovať bez použitia chemických prostriedkov ochrany (Van Bruggen, 1995).
Vyššie uvedené vysvetľuje veľkú pozornosť, ktorú vedci z rôznych krajín venujú štúdiu populácií P. infestans, dynamike ich početnosti a genetickému zloženiu, ako aj genetickým mechanizmom variability.
Životný cyklus R. INFESTANOV
Oomycete Phytophthora infestans vyvíja medzibunkové mycélium s haustoria vo vnútri zemiakových listov. Kŕmenie listovými pletivami spôsobuje tvorbu tmavých škvŕn, ktoré vo vlhkom počasí sčernejú a hnijú. Pri silnej porážke zomiera celý list. Po určitom čase kŕmenia sa na podhubí - výtrusy - tvoria výrastky, ktoré rastú von cez prieduchy. Za vlhkého počasia vytvárajú okolo škvŕn na spodnej strane listov biely kvet. Na koncoch sporangioforov sa vytvárajú zoosporangia citrónovitého tvaru, ktoré sa odlamujú a sú unášané postrekom dažďom (obr. 1). Pádom kvapiek vody na povrch zemiakového listu klíčia sporangie so 6-8 zoospórami, ktoré sú po určitom čase pohybu zaoblené, pokryté membránou a klíčia zárodočnou trubičkou. Klíček preniká cez listové tkanivo cez prieduchy. Za určitých podmienok môžu sporangie rásť v rastovej trubici priamo do listového tkaniva. Za priaznivých podmienok je čas od infekcie do vytvorenia novej sporulácie iba 3-4 dni.
Akonáhle sú sporangie na zemi a filtrované cez pôdu, sú schopné infikovať hľuzy. Silne postihnuté hľuzy počas skladovania hnijú; u slabo postihnutých môže infekcia pretrvávať až do nasledujúcej sezóny. Okrem toho pôvodca neskorej plesne môže v zime pretrvávať v podobe oospór (hrubostenných pokojových sexuálnych spór) v pôde na zvyškoch rastlín a na semenách rajčiaka. Oospory sa tvoria na živých orgánoch rastlín, keď sa kmene rôznych druhov párenia stretnú s nadmernou vlhkosťou. Na jar sa na zasadených infikovaných hľuzách a na zvyškoch rastlín oospórami vytvára nepohlavná sporulácia; zoospóry vstupujú do pôdy a spôsobujú infekciu spodných listov rastlín. V niektorých prípadoch môže mycélium rásť z infikovanej hľuzy pozdĺž zelenej časti rastliny a zvyčajne sa objaví v hornej časti stonky.
Významný rozdiel medzi oomycetami a väčšinou húb spočíva v prevahe diplofázy v ich životnom cykle s gametickou meiózou a klíčením zygotov (oospór) bez redukčného jadrového štiepenia. Zdá sa, že táto vlastnosť, plus dipolárny heterotallizmus nahrádzajúci bisexualitu, umožňuje aplikovať na oomycety prístupy vyvinuté pre štúdium populácií vyšších eukaryotov (analýza panmixie a ďalšieho členenia populácií, intra- a interpopulačné toky génov atď.). Tri faktory však neumožňujú úplné prenesenie týchto prístupov pri štúdiu populácií P. infestans.
1. Spolu s hybridnými oospórami sa v populáciách vytvárajú aj samorodné a partenogenetické oospory (Fife a Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003) a na ich ovplyvnenie môže byť dostatočná frekvencia ich vzniku. na výsledkoch skúšky.
2. Pohlavný proces u P. infestans nevýznamne prispieva k dynamike veľkosti populácie, pretože huba sa množí hlavne vegetatívnymi spórami, ktoré tvoria viac ako 90% výsledkov analýzy párenia tradičnou metódou na živnom médiu. ... vegetačným obdobím je niekoľko generácií bezpohlavnej sporulácie (vývoj polycyklických chorôb). Oospory zohrávajú dôležitú úlohu pri ochrane organizmu v období, keď zelené rastliny chýbajú (v zime), a pri primárnej infekcii sadeníc. Potom počas leta dôjde k klonálnej reprodukcii a zvýšeniu alebo naopak zníženiu počtu jednotlivých klonov, ktoré vznikli v dôsledku sexuálnej rekombinácie, čo je určené hlavne výberom tých prispôsobivejších. Preto môže byť pomer jednotlivých klonov v populácii na začiatku a na konci epifytotík úplne odlišný.
3. Popísaný cyklus je charakteristický pre pôvodné populácie P. infestans v ich domovine, v Strednej Amerike. V iných oblastiach sveta nebol pohlavný proces známy viac ako 100 rokov; vegetačné mycélium v infikovaných zemiakových hľuzách bolo štádiom zimovania. Životný cyklus bol úplne agamický a šírenie malo ohniskovú povahu: infekcia z jednotlivých infikovaných zasadených hľúz prešla na listy a tvorila primárne ohniská choroby, ktoré mohli splynúť s masívnym vývojom choroby.
V niektorých regiónoch teda môže dochádzať k striedaniu sexuálnych a nepohlavných cyklov, zatiaľ čo v iných - iba k nepohlavnému cyklu.
Pôvod P. INFESTANS
P. infestans sa v Európe objavil na konci prvej polovice 1991. storočia. Keďže zemiak pochádza z severovýchodnej časti Južnej Ameriky, predpokladalo sa, že parazit bol odtiaľto dovezený do Európy počas rozmachu čílskeho ľadu. Štúdie vykonané na zemiakovej stanici Rockefellerovho centra v údolí Toluca v Mexiku však prinútili prehodnotiť tento názor (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. V údolí Toluca majú miestne hľuzovité druhy zemiakov (Solanum demissum, S. bulbocastanum atď.) Rôzne súbory génov pre vertikálnu rezistenciu kombinovanú s vysokou úrovňou nešpecifickej rezistencie, čo naznačuje dlhý spoločný vývoj s parazitom. Juhoamerické druhy vrátane úrodných zemiakov nemajú gény odolnosti.
2. V údolí Toluca sa nachádzajú izoláty s páriacimi sa typmi A1 a A2, v dôsledku čoho je rozšírená krížená populácia P. infestans; zatiaľ čo vo vlasti pestovaných zemiakov v Južnej Amerike sa parazit šíri klonálne.
3. V údolí Toluca každoročne existujú závažné epidémie neskorej plesne. Preto je medzi severoamerickými výskumníkmi (Cornell University) stanovený názor na Strednú Ameriku (Stredná Amerika) ako na miesto, kde sa rodí fytoftóra zemiaková (Goodwin et al., 1994).
Juhoamerickí vedci tento názor nezdieľajú. Veria, že pestovaný zemiak a jeho parazit P. infestans majú spoločnú domovinu - juhoamerické Andy. Svoj názor podporili molekulárnymi štúdiami o analýze polymorfizmov DNA mitochondriálneho genómu (mtDNA) a jadrových génov RAS a β-tubulínu (Gomez-Alpizar et al., 2007). Ukázali, že kmene zhromaždené z rôznych častí sveta pochádzajú z troch odlišných rodových línií, ktoré sa (všetky tri) nachádzajú v juhoamerických Andách. Andské haplotypy sú potomkami dvoch línií: izoláty najstaršej línie mtDNA sa nachádzajú na divo rastúcich Solanaceae z časti Anarrhicomenum v Ekvádore, zatiaľ čo izoláty druhej línie sú bežné na zemiakoch, rajčiakoch a divých nočných tieňoch. V Toluce dokonca vzácne haplotypy pochádzajú iba z jednej línie, genetická variabilita kmeňov Toluca (nízka alelická frekvencia niektorých variabilných miest) naznačuje silný zakladateľský efekt v dôsledku nedávneho driftu.
Okrem toho sa v Andách našiel nový druh P. andina, morfologicky a geneticky podobný druhu P. infestans, ktorý podľa autorov poukazuje na Andy ako horúce miesto špeciácie v rode Phytophthora. Napokon v Európe a Spojených štátoch zahŕňajú populácie P. infestans obidve andské línie, zatiaľ čo v Toluce iba jednu.
Táto publikácia podnietila reakciu skupiny vedcov z rôznych krajín, ktorí vykonali veľa experimentálnych prác na revíziu predtým vykonanej štúdie (Goss et al., 2014). V tejto práci sa najskôr na štúdium polymorfizmu DNA použili informatívnejšie sekvencie mikrosatelitnej DNA; po druhé, na analýzu klastrovania, migračných trás, času divergencie populácií atď. boli použité pokročilejšie modely (F-štatistika, Bayesovské aproximácie atď.) a po tretie, porovnanie bolo použité nielen s andským druhom P. andina, v ktorom bola založená hybridná povaha (P. infestans x Phytophthora sp.) , ale aj s mexickým endemickým druhom P. mirabilis, P. Ipomoeae a Phytophthora phaseoli - geneticky blízkymi P. infestans patriacimi do tej istej kladu (Kroon et al., 2012). Na základe týchto analýz sa jednoznačne preukázalo, že koreňová časť fylogenetického stromu všetkých druhov rodu Phytophthora, ktorá bola do štúdie zahrnutá, s výnimkou hybridu P. andina, patrí k mexickým kmeňom a migračný tok má smer Mexiko - Andy a nie naopak a jeho začiatok sa zhoduje s európskym kolonizácia Nového sveta (pred 300-600 rokmi). K vzniku druhu P. infestans špecializovanému na porážku zemiakov došlo teda v sekundárnom genetickom centre tvorby hľuzovitých solanaceae, t.j. v Strednej Amerike.
Genóm P. INFESTANS
V roku 2009 medzinárodný tím vedcov sekvenoval kompletný genóm P infestans (Haas et al, 2009), ktorého veľkosť bola 240 MB. Je to niekoľkonásobne viac ako u príbuzných druhov P. sojae (95 Mb), ktoré spôsobujú hnilobu koreňov sóje, a P. Ramorum (65 Mb), ktoré ovplyvňujú také cenné druhy stromov ako dub, buk a niektoré ďalšie. Získané údaje ukázali, že genóm obsahuje veľké množstvo kópií opakovaných sekvencií - 74%. Genóm obsahuje 17797 génov kódujúcich proteíny, z ktorých väčšina sú gény zapojené do bunkových procesov vrátane replikácie DNA, transkripcie a translácie proteínov.
Porovnanie genómov rodu Phytophthora odhalilo neobvyklú organizáciu genómu pozostávajúcu z blokov sekvencií konzervovaných génov, v ktorých je hustota génov relatívne vysoká a obsah opakovaných sekvencií relatívne nízky, a jednotlivých oblastí s nekonzervovanými sekvenciami génov, s nízkou hustotou génov a vysokým obsahom opakujúcich sa oblastí. Konzervatívne bloky tvoria 70% (12440 604 3700) všetkých génov kódujúcich proteín P. infestans. V rámci konzervatívnych blokov sú gény zvyčajne blízko seba umiestnené s priemernou intergénnou vzdialenosťou XNUMX bp. V oblastiach medzi konzervatívnymi blokmi je intergénna vzdialenosť väčšia (XNUMX XNUMX bp) v dôsledku zvýšenia hustoty opakujúcich sa prvkov. Rýchlo sa rozvíjajúce efektorové sekrečné gény sú lokalizované v génovo chudobných oblastiach.
Sekvenčná analýza genómu P. Infestans ukázala, že približne jedna tretina genómu patrí k transponovateľným prvkom. Genóm P. infestans obsahuje podstatne viac rôznych rodín transpozónov ako iné známe genómy. Väčšina transpozónov P. infestans patrí do rómskej rodiny.
V genóme P. infestans bolo identifikované veľké množstvo špecifických rodov génov zapojených do patogenézy. Ich významná časť kóduje efektorové proteíny, ktoré menia fyziológiu hostiteľskej rastliny a prispievajú k jej infekcii. Spadajú do dvoch širokých kategórií: apoplastické efektory, ktoré pôsobia v medzibunkových priestoroch (apoplasty), a cytoplazmatické efektory, ktoré vstupujú do buniek prostredníctvom haustória. Medzi apoplastické efektory patria vylučované hydrolytické enzýmy, ako sú proteázy, lipázy a glykozylázy, ktoré ničia rastlinné bunky; inhibítory obranných enzýmov hostiteľa rastlín a nekrotizujúce toxíny, ako sú proteíny podobné Nep1 (NPL) a malé proteíny bohaté na cysteín (SCR) podobné Pcf.
Efektorové gény P. infestans sú početné a zvyčajne väčšie ako nepatogénne gény. Najznámejšie sú cytoplazmatické efektory RXLR a Crinkler (CNR). Typickými cytoplazmatickými efektormi oomycetov sú proteíny RXLR. Všetky doteraz objavené efektorové gény RXLR obsahujú amino-koncovú skupinu Arg-XLeu-Arg, kde X je aminokyselina. Výsledkom štúdie bolo zistenie, že v genóme P. infestans existuje 563 génov RXLR, čo je o 60% viac ako v prípade P. sojae a P. ramorum. Približne polovica génov RXLR v genóme P. infestans je druhovo špecifická. RXLR efektory majú širokú škálu sekvencií. Medzi nimi bola identifikovaná jedna veľká a 150 malých rodín. Na rozdiel od hlavného proteómu sú efektorové gény RXLR zvyčajne lokalizované v génovo chudobných a na opakovanie bohatých oblastiach genómu. Mobilné prvky, ktoré určujú dynamiku týchto oblastí, uľahčujú rekombináciu v týchto génoch.
Cytoplazmatické CRN efektory sa pôvodne identifikovali v transkriptoch P. infestans kódujúcich peptidy nekrózy rastlinného tkaniva. Od ich objavu sa o rodine týchto efektorov vedelo len málo. Analýza genómu P. Infestans odhalila obrovskú rodinu 196 génov CRN, ktorá je významne väčšia ako v prípade P. sojae (100 CRN) a P. ramorum (19 CRN). Rovnako ako RXLR, aj CRN sú modulárne proteíny a pozostávajú z vysoko konzervatívnej N-koncovej LFLAK domény (50 aminokyselín) a susednej DWL domény obsahujúcej rôzne gény. Väčšina CRN (60%) obsahuje signálny peptid.
Bola študovaná možnosť rôznych CRN narušiť bunkové procesy hostiteľskej rastliny. Pri analýze nekrózy rastlín odstránenie CRN2 proteínov umožnilo identifikovať C-koncovú oblasť pozostávajúcu z 234 aminokyselín (polohy 173-407, doména DXG) a spôsobujúcich bunkovú smrť. Analýza génov CRN P. infestans odhalila štyri rôzne C-koncové oblasti, ktoré tiež spôsobujú bunkovú smrť v rastline. Patria sem novo identifikované domény DC (P. Infestans má 18 génov a 49 pseudogénov), ako aj domény D2 (14 a 43) a DBF (2 a 1), ktoré sú podobné proteínkinázam. Proteíny CRN domén exprimovaných v rastline sú konzervované (v neprítomnosti signálnych peptidov) v rastlinnej bunke a stimulujú bunkovú smrť intracelulárnym mechanizmom. Ďalších 255 sekvencií obsahujúcich domény CRN s najväčšou pravdepodobnosťou nefunguje ako gén.
Nárast počtu a veľkosti rodiny efektorových génov RXLR a CRN bol pravdepodobne spôsobený nealelickou homológnou rekombináciou a duplikáciou génov. Napriek skutočnosti, že genóm obsahuje veľké množstvo aktívnych mobilných prvkov, stále neexistujú priame dôkazy o prenose efektorových génov.
Metódy použité pri štúdiu populačnej štruktúry
Štúdium genetickej štruktúry populácií je v súčasnosti založené na analýze čistých kultúr kmeňov, z ktorých sa skladá. Analýza populácií bez izolácie čistých plodín sa tiež vykonáva na špecifické účely, ako je napríklad štúdium agresivity populácie alebo prítomnosť kmeňov rezistentných voči fungicídom v nej (Filippov a kol., 2004; Derevyagina a kol., 1999). Tento typ výskumu zahŕňa použitie špeciálnych metód, ktorých popis je nad rámec tohto preskúmania. Na komparatívnu analýzu kmeňov sa používa množstvo metód založených jednak na analýze štruktúry DNA, jednak na štúdiu fenotypových prejavov. Porovnávacia analýza populácií sa musí zaoberať veľkým počtom izolátov, čo kladie určité požiadavky na použité metódy. V ideálnom prípade by mali spĺňať nasledujúce požiadavky (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- byť lacné, ľahko implementovateľné, nevyžadujú si značné časové náklady, byť založené na všeobecne dostupných technológiách (napríklad PCR);
- musí generovať dostatočne veľký počet nezávislých znakov kodominantných znakov;
- majú vysokú reprodukovateľnosť;
- použiť minimálne množstvo tkaniva na vyšetrenie;
- byť špecifické pre substrát (kontaminácia prítomná v kultúre by nemala mať vplyv na výsledky);
- nevyžadujú použitie nebezpečných postupov a vysoko toxických chemikálií.
Bohužiaľ neexistujú žiadne metódy zodpovedajúce všetkým vyššie uvedeným parametrom. Pre komparatívnu štúdiu kmeňov v našej dobe sa používajú metódy založené na analýze fenotypových znakov: virulencia k odrodám zemiakov a paradajok (zemiakové a paradajkové rasy), druh párenia, spektrá izoenzýmov peptidázy a glukózo-6-fosfátizomerázy a analýza štruktúry DNA: polymorfizmus dĺžky reštrikčný fragment (RFLP), ktorý je zvyčajne doplnený hybridizačnou sondou RG 57, analýza mikrosatelitných repetícií (SSR a InterSSR), amplifikácia náhodnými primérmi (RAPD), amplifikácia reštrikčných fragmentov (AFLP), amplifikácia primérmi homológnymi so sekvenciami mobilných prvkov (napríklad Inter SINE PCR), stanovenie haplotypov mitochondriálnej DNA.
Stručný popis metód komparatívnej štúdie kmeňov použitých pri práci s P. Infestansom
Fenotypové znaky
„Zemiakové“ preteky
„Zemiakové“ rasy sú bežne skúmané a používané značky. „Jednoduché zemiakové“ rasy majú jeden gén pre zemiakovú virulenciu, „komplexné“ - najmenej dva. Black a spol. (1953), ktorí zhrnuli všetky údaje, ktoré majú k dispozícii, zistili, že rasa phytophthora je schopná infikovať rastliny génom / génmi rezistencie zodpovedajúcimi génu / génom virulencie P. infestans a našli rasy 1, 2, 3 a 4, ktoré infikujú rastliny. s génmi R1, R2, R3 a R4, t.j. interakcia medzi parazitom a hostiteľom nastáva podľa princípu gén pre gén. Ďalej Black za účasti Galleglyho a Malcolmsona objavil gény rezistencie R5, R6, R7, R8, R9, R10 a R11 a tiež zodpovedajúce rasy (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Existuje veľké množstvo údajov o rasovom zložení patogénu z rôznych oblastí. Bez podrobnej analýzy týchto údajov naznačíme iba všeobecný trend: tam, kde sa používali odrody s novými génmi rezistencie alebo ich kombináciami, najskôr došlo k určitému oslabeniu plesne neskorej, ale potom sa objavili rasy so zodpovedajúcimi génmi virulencie a boli vybrané a ohniská neskorej plesne pokračovali. Špecifická virulencia proti prvým 4 génom rezistencie (R1-R4) bola zriedka pozorovaná v zbierkach zhromaždených pred zavedením odrôd s týmito génmi do kultivácie, ale počet virulentných kmeňov prudko vzrástol, keď patogén parazitoval na odrodách nesúcich tieto gény. Gény 5-11 boli na druhej strane v zbierkach úplne bežné (Shaw, 1991).
Štúdia pomeru rôznych rás počas vegetačného obdobia, uskutočnená koncom 1980. rokov, ukázala, že na začiatku vývoja ochorenia v populácii prevládajú klony s nízkou agresivitou a 1 - 2 génmi virulencie.
Ďalej s vývojom neskorej plesne klesá koncentrácia pôvodných klonov a zvyšuje sa počet „zložitých“ rás s vysokou agresivitou. Výskyt druhého druhu na konci sezóny dosahuje 100%. Pri skladovaní hľúz dochádza k zníženiu agresivity a strate jednotlivých génov virulencie. Dynamika výmeny klonov sa môže vyskytnúť v rôznych odrodách rôznymi spôsobmi (Rybakova & Dyakov, 1990). Naše štúdie v rokoch 2000 - 2010 však ukázali, že medzi kmeňmi izolovanými zo zemiakov aj paradajok sa od samého začiatku epifytotík vyskytujú zložité rasy. Je to pravdepodobne spôsobené zmenami v populáciách P. Infestans v Rusku.
V rokoch 1988-1995 frekvencia výskytu „superraces“ so všetkými alebo takmer so všetkými génmi virulencie v rôznych regiónoch dosiahla 70-100%. Takáto situácia bola zaznamenaná napríklad v Bielorusku, v leningradských, moskovských regiónoch, v Severnom Osetsku a v Nemecku (Ivanyuk a kol., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin a kol., 1995).
„Paradajkové“ preteky
V kultivaroch rajčiakov sa našli iba 2 gény odolnosti proti neskorej plesni - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) a Ph2 (Al-Kherb, 1988). Rovnako ako v prípade zemiakových rás, aj tu dochádza k interakcii medzi paradajkami a P. infestans podľa génu po géne. Rasa T0 infikuje odrody, ktoré nemajú gény rezistencie (väčšina priemyselne používaných odrôd), rasa T1 infikuje odrody génom Ph1 (Ottawa) a rasa T2 infikuje odrody génom Ph2.
V Rusku sa takmer výlučne T0 nachádzal na zemiakoch; Na začiatku sezóny dominovala T0 na rajčiakoch, neskôr ju však nahradili preteky T1 (Dyakov a kol., 1975, 1994). Po roku 2000 sa T1 na zemiakoch v mnohých populáciách začal vyskytovať na samom začiatku epifytotického obdobia. V Spojených štátoch boli kmene zemiakov nepatogénne pre paradajky, rovnako ako rasy T0, T1 a T2, zatiaľ čo T1 a T2 prevažovali na rajčiakoch (Vartanian a Endo, 1985; Goodwin a kol., 1995).
Typ párenia
Na uskutočnenie štúdie sú potrebné testovacie (referenčné) kmene so známymi typmi párenia - A1 a A2. Testovaný izolát sa im naočkuje v pároch do Petriho misiek s ovseným agarovým médiom. Po inkubácii počas 10 dní sa platne skúmajú na prítomnosť alebo neprítomnosť oospór v médiu v kontaktnej zóne kmeňov. Existujú 4 možnosti: kmeň patrí do párovacieho typu A1, ak tvorí oospóry s testerom A2, do A2, ak vytvára oospóry s testerom A1, do A1A2, ak vytvára oospory s oboma testermi, alebo je sterilný (00), ak netvorí oospóry bez testeru (posledné dve skupiny sú zriedkavé).
Aby sa rýchlejšie určili typy párenia, uskutočnili sa pokusy identifikovať oblasti genómu spojené s typom párenia s cieľom ich ďalšieho použitia na určenie typu párenia pomocou PCR. Jeden z prvých úspešných experimentov na identifikáciu takéhoto miesta uskutočnili americkí vedci (Judelson et al., 1995). Pomocou metódy RAPD boli schopní identifikovať oblasť W16 spojenú s typom párenia u potomkov dvoch skrížených izolátov a navrhnúť pár 24 bp primerov pre jej amplifikáciu (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') a W16-2 (5') -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Po reštrikcii produktu PCR reštrikčným enzýmom HaeIII bolo možné izolovať izoláty párovaním typov Al a A1.
Ďalším pokusom o získanie markerov PCR na určenie typov párenia sa uskutočnili kórejskí vedci (Kim, Lee, 2002). Identifikovali konkrétne výrobky pomocou metódy AFLP. Vo výsledku bol vyvinutý pár primerov PHYB-1 (forward) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') a PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTT-3'), ktoré umožňujú selektívnu amplifikáciu genómovej oblasti spojenej s párením A2. Následne pokračovali v tejto práci a navrhli priméry 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, dopredu) a 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), ktoré umožňovali selektívnu amplifikáciu oblasti Mat-A1 charakteristickej pre kmene s páriacim typom A1. Použitie PCR diagnostiky typov párenia ukázalo dobré výsledky v štúdiu populácií P. infestans v Českej republike (Mazakova et al., 2006), Tunisku (Jmour, Hamada, 2006) a ďalších regiónoch. V našom laboratóriu (Mytsa, Elansky, nepublikované) bolo analyzovaných 34 kmeňov P. infestans izolovaných z chorých zemiakových a paradajkových orgánov v rôznych oblastiach Ruska (Kostroma, Ryazan, Astrachan, Moskovská oblasť). Výsledky PCR analýzy s použitím špecifických primérov sa viac ako 90% zhodovali s výsledkami analýzy párového typu tradičnou metódou na živnom médiu.
Tabuľka 1. Variabilita rezistencie v rámci klonu Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Miesto odberu vzorky | Počet analyzovaných izolátov | Počet citlivých (S), slabo rezistentných (SR) a rezistentných (R) kmeňov, ks (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Čita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Mesto Jekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sachalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk región | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaxylová rezistencia ako populačný marker
Na začiatku 1980. rokov boli v rôznych regiónoch zaznamenané silné ohniská neskorej plesne spôsobené kmeňmi P. infestans rezistentnými na metalaxyl. Farmy na zemiaky v mnohých krajinách utrpeli značné straty (Dowley a O'Sullivan, 1981; Davidse a kol., 1983; Derevyagina, 1991). Odvtedy sa v mnohých krajinách sveta neustále monitoruje výskyt kmeňov rezistentných na fenylamid v populáciách P. infestans. Okrem praktického posúdenia vyhliadok na použitie liekov obsahujúcich fenylamid, budovania systému ochranných opatrení a predpovedania epifytotík sa rezistencia na tieto lieky stala jedným z charakteristických znakov široko používaných pre komparatívnu analýzu populácií tohto patogénu. Použitie rezistencie na metalaxyl v porovnávacích populačných štúdiách by sa však malo uskutočňovať s prihliadnutím na skutočnosť, že: 1 - genetický základ rezistencie ešte nebol presne určený, 2 - rezistencia na metalaxyl je selektívne závislá vlastnosť, ktorá sa môže líšiť v závislosti od použitia fenylamidov, 3 - rôzne stupeň citlivosti na metalaxylové kmene v rámci jednej klonálnej línie (tabuľka 1).
Spektrum izozýmov
Izozýmové markery sú zvyčajne nezávislé od vonkajších podmienok, vykazujú mendelovské dedičstvo a sú kodominantné, čo umožňuje rozlišovať medzi homo- a heterozygotmi. Použitie proteínov ako génových markerov umožňuje identifikovať veľké reorganizácie genetického materiálu vrátane chromozomálnych a genómových mutácií, ako aj substitúcie jednotlivých aminokyselín.
Elektroforetické štúdie bielkovín ukázali, že väčšina enzýmov existuje v organizmoch vo forme niekoľkých frakcií líšiacich sa elektroforetickou pohyblivosťou. Tieto frakcie sú výsledkom kódovania viacerých foriem enzýmov rôznymi lokusmi (izozýmy alebo izozýmy) alebo rôznymi alelami rovnakého lokusu (alozymy alebo aloenzýmy). To znamená, že izozýmy sú rôzne formy jedného enzýmu. Rôzne formy majú rovnakú katalytickú aktivitu, ale mierne sa líšia v substitúciách jednotlivých aminokyselín v peptide a v náboji. Takéto rozdiely sa odhalia počas elektroforézy.
Pri štúdiu kmeňov P. infestans sa používajú spektrá izoenzýmov dvoch proteínov, peptidázy a glukóza-6-fosfátizomerázy (tento enzým je v ruských populáciách monomorfný, preto metódy jeho štúdia nie sú v tejto práci uvedené). Na ich rozdelenie na izozýmy v elektrickom poli sa na gélovú platňu umiestnenú v elektrickom poli aplikujú proteínové prípravky izolované zo študovaných organizmov. Rýchlosť difúzie jednotlivých proteínov v géli závisí od náboja a molekulovej hmotnosti; preto sa v elektrickom poli zmes proteínov rozdelí na jednotlivé frakcie, ktoré je možné vizualizovať pomocou špeciálnych farbív.
Štúdium izoenzýmov peptidázy sa uskutočňuje na géloch z acetátu, škrobu alebo polyakrylamidu celulózy. Najvýhodnejšia je metóda založená na použití gélov z acetátu celulózy vyrobených spoločnosťou Helena Laboratories Inc. Nevyžaduje veľké množstvo testovaných materiálov, umožňuje získať kontrastné pásy na géle po elektroforéze pre oba enzýmové lokusy, jeho implementácia nevyžaduje veľké časové a materiálové náklady (obr. 2).
Malý kúsok mycélia sa prenesie do 1,5 ml mikroskúmavky, do ktorej sa pridajú 1 - 2 kvapky destilovanej vody. Potom sa vzorka homogenizuje (napríklad elektrickou vŕtačkou s plastovým nástavcom vhodným pre mikroskúmavku) a sedimentuje sa 25 sekúnd na centrifúge pri 13000 8 ot./min. XNUMX μl z každej mikroskúmavky. supernatant sa prevedie na platňu aplikátora.
Gél z acetátu celulózy sa vyberie z nádoby s tlmivým roztokom, odsaje sa medzi dva listy filtračného papiera a umiestni sa pracovnou vrstvou nahor na plastovú základňu aplikátora. Roztok z platne sa nanáša aplikátorom na gél 2-4 krát. Gél sa prenesie do elektroforetickej komory,
Tabuľka 2. Zloženie roztoku použitého na farbenie gélu acetátu celulózy pri analýze izoenzýmov peptidázy, kvapka farby (brómfenolová modrá) je umiestnená na okraj gélu.
TRIS HCI, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidáza, 1000 5 U / ml XNUMX kvapiek
o-dianisidín, 4 mg / ml 8 kvapiek
MgCl2, 20 mg / ml 2 kvapky
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 kvapiek
Oxidáza L-aminokyseliny, 20 u / ml 2 kvapky
Elektroforéza sa uskutočňuje 20 minút. pri 200 V. Po elektroforéze sa gél prenesie na lakovací stôl a zafarbí sa špeciálnym lakovacím roztokom (tabuľka 2). 10 ml 1,6% DIFCO agaru sa predbežne rozpustí v mikrovlnnej rúre, ochladí sa na 60 ° C, potom sa 2 ml agaru zmiešajú s náterovou zmesou a nalejú sa na gél. Pruhy sa objavia do 15-20 minút. Bezprostredne pred zmiešaním roztoku s roztaveným agarom sa pridá činidlo oxidázy L-aminokyseliny.
V ruských populáciách je lokus Pep 1 reprezentovaný genotypmi 100/100 a 92/100. Homozygot 92/92 je extrémne zriedkavý (asi 0,1%). Locus Rehr 2 je reprezentovaný tromi genotypmi 100/100, 100/112 a 112/112 a všetky 3 varianty sú celkom bežné (Elanky a Smirnov, 2003, obr. 2).
Výskum genómu
Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov s následnou hybridizáciou (RFLP-RG 57)
Celková DNA sa spracuje reštrikčným enzýmom Eco R1, fragmenty DNA sa separujú elektroforézou na agarózovom géli. Jadrová DNA je veľmi veľká a má veľa opakujúcich sa sekvencií, čo sťažuje priamu analýzu mnohých fragmentov získaných pôsobením reštrikčných enzýmov. Preto sa fragmenty DNA oddelené v géli prenesú na špeciálnu membránu a použijú sa na hybridizáciu so sondou RG 57, ktorá obsahuje nukleotidy označené rádioaktívnymi alebo fluorescenčnými značkami. Táto sonda hybridizuje s opakujúcimi sa genómovými sekvenciami (Goodwin a kol., 1992, Forbes a kol., 1998). Po vizualizácii výsledkov hybridizácie na ľahkom alebo rádioaktívnom materiáli sa získa hybridizačný profil s viacerými lokusmi (odtlačok prsta), predstavovaný 25-29 fragmentmi (Forbes a kol., 1998). Nepohlavné (klonálne) potomstvo bude mať rovnaké profily. Podľa usporiadania pásov na elektroforetograme je možné posúdiť podobnosti a rozdiely porovnávaných organizmov.
Haplotypy mitochondriálnej DNA
Vo väčšine eukaryotických buniek je mtDNA prezentovaná vo forme dvojvláknovej kruhovej molekuly DNA, ktorá sa na rozdiel od nukleárnych chromozómov eukaryotických buniek replikuje semikonzervatívne a nie je spojená s proteínovými molekulami.
Sekvenoval sa mitochondriálny genóm P. infestans a niekoľko prác sa venovalo analýze dĺžok restrikčných fragmentov (Carter a kol., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Potom, čo Griffith a Shaw (1998) vyvinuli jednoduchú a rýchlu metódu na stanovenie mtDNA haplotypov, stal sa tento marker jedným z najpopulárnejších v štúdiách P. Infestansa. Podstata metódy spočíva v postupnej amplifikácii dvoch fragmentov mitochondriálnej DNA (zo spoločného genómu) pomocou primérov F2-R2 a F4-R4 (tabuľka 3) a ich následná reštrikcia reštrikčnými enzýmami MspI (1. fragment) a EcoR1 (2. fragment). Metóda umožňuje identifikovať 4 haplotypy: Ia, IIa, Ib, IIb. Typ II sa líši od typu I prítomnosťou inzertu veľkosti 1881 bp a odlišným umiestnením reštrikčných miest v oblastiach P2 a P4 (obr. 3).
Od roku 1996 boli medzi kmeňmi zhromaždenými na území Ruska zaznamenané iba haplotypy Ia a IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Môžu byť identifikované po separácii reštrikčných produktov primérom F2-R2 v elektrickom poli (obr. 4, 5). Typy mtDNA sa používajú pri porovnávacej analýze kmeňov a populácií. V rade štúdií sa na izoláciu klonálnych línií a pasportizáciu izolátov P. infestans použili typy mitochondriálnej DNA (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Použitím metódy PCR-RFLP sa dospelo k záveru, že mtDNA je heterogénna v rovnakom kmeni P. infestans (Elansky a Milyutina, 2007). Podmienky zosilnenia: 1x (500 s. 94 ° C), 40x (30 s. 90 ° C, 30 s. 52 ° C, 90 s. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakčná zmes: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polymeráza, 1x 2,5 mM tlmivý roztok MgCl2-Taq, 0,2 mM každý dNTP, 30 pM primer a 5 ng analyzovanej DNA, deionizovaná voda - do 20 μl.
Obmedzenie produktu PCR sa uskutočňuje počas 4 až 6 hodín pri teplote 37 ° C. Reštrikčná zmes (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x reštrikčný tlmivý roztok (2 μl), deionizovaná voda (6 μl), produkt PCR (10 μl).
Tabuľka 3. Priméry použité na amplifikáciu mtDNA polymorfných oblastí
Locus | primer | Dĺžka a umiestnenie primeru | Dĺžka produktu PCR | Obmedziť |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Náhodná amplifikácia priméru (RAPD)
Pri uskutočňovaní RAPD sa používa jeden primer (niekedy niekoľko primérov súčasne) s ľubovoľnou nukleotidovou sekvenciou, obvykle dlhou 10 nukleotidov, s vysokým obsahom (od 50%) GC nukleotidov a nízkou teplotou hybridizácie (asi 35 ° C). Takéto priméry „pristávajú“ na mnohých komplementárnych miestach v genóme. Po amplifikácii sa získa veľké množstvo amplikónov. Ich počet závisí od použitého priméru (primérov) a reakčných podmienok (koncentrácia MgCl2 a teplota žíhania).
Vizualizácia amplikónov sa uskutočňuje destiláciou v polyakrylamidovom alebo agarózovom géli. Pri vykonávaní RAPD analýzy je potrebné starostlivo sledovať čistotu analyzovaného materiálu, pretože kontaminácia inými živými objektmi môže spôsobiť významné zvýšenie počtu artefaktov, ktorých je pri analýze čistého materiálu dosť veľa (Perez a kol., 1998). Využitie tejto metódy pri štúdiu genómu P. infestans sa odráža v mnohých prácach (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Výber reakčných podmienok a primérov (študovaných bolo 51 10-nukleotidových primérov) je uvedený v článku Abu-El Samena a kol., (2003).
Analýza opakovania mikrosatelitu (SSR)
Mikrosatelitné opakovania (opakovania jednoduchých sekvencií, SSR) sú tandemovo opakované krátke sekvencie 1-3 (niekedy až 6) nukleotidov prítomných v jadrových genómoch všetkých eukaryotov. Počet po sebe nasledujúcich opakovaní sa môže pohybovať od 10 do 100. Mikrosatelitové lokusy sa vyskytujú s pomerne vysokou frekvenciou a sú viac alebo menej rovnomerne distribuované v celom genóme (Lagercrantz et al., 1993). Polymorfizmus mikrosatelitných sekvencií je spojený s rozdielmi v počte opakovaní základného motívu. Mikrosatelitné markery sú kodominantné, čo umožňuje ich použitie na analýzu populačnej štruktúry, určenie príbuzenstva, migračných ciest genotypov atď. Medzi ďalšie výhody týchto markerov je potrebné poznamenať ich vysoký polymorfizmus, dobrú reprodukovateľnosť, neutralitu a schopnosť vykonávať automatickú analýzu a hodnotenie. Analýza polymorfizmu mikrosatelitných repetícií sa uskutočňuje pomocou PCR amplifikácie s použitím primerov komplementárnych k jedinečným sekvenciám lemujúcim mikrosatelitné lokusy. Spočiatku sa analýza uskutočňovala s oddelením reakčných produktov na polyakrylamidovom géli. Neskôr zamestnanci Applied Biosystems navrhli použitie fluorescenčne značených primérov s detekciou reakčných produktov pomocou automatického laserového detektora (Diehl a kol., 1990) a potom štandardných automatických DNA sekvenátorov (Ziegle a kol., 1992). Označenie primérov rôznymi fluorescenčnými farbivami umožňuje analyzovať niekoľko markerov naraz na jednom pruhu, a podľa toho výrazne zvýšiť produktivitu metódy a zvýšiť presnosť analýzy.
Prvé publikácie venované použitiu analýzy SSR na štúdium P. infestans sa objavili začiatkom roku 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Nie všetky markery navrhnuté autormi vykazovali dostatočnú mieru polymorfizmu, dva z nich (4B a G11) však boli zahrnuté do súboru 12 markerov SSR navrhnutých Leesom a kol. (2006) a následne prijatých výskumnou sieťou Eucablight (www.eucablight .org) ako štandard pre P. infestans. O niekoľko rokov neskôr bola publikovaná štúdia o vytvorení systému pre multiplexnú analýzu DNA P. infestans na základe ôsmich SSR markerov (Li et al., 2010). Nakoniec po vyhodnotení všetkých skôr navrhnutých markerov a výbere tých najinformatívnejších z nich, ako aj po optimalizácii primerov, fluorescenčných značiek a podmienok amplifikácie, rovnaká skupina autorov predstavila systém pre jednokrokovú multiplexnú analýzu vrátane 12 markerov (tabuľka 4; Li et al. , 2013a). Priméry použité v tomto systéme boli vybrané a označené jedným zo štyroch fluorescenčných markerov (FAM, VIC, NED, PET) tak, aby sa rozsahy veľkostí alel primerov s rovnakými značkami neprekrývali.
Autori vykonali analýzu na zosilňovači PTC200 (MJ Research, USA) pomocou súprav QIAGEN multiplex PCR alebo súprav QIAGEN Typeit Microsatellite PCR. Objem reakčnej zmesi bol 12.5 ul. Podmienky amplifikácie boli nasledujúce: pre QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min.), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min.); Pre QIAGEN Type-it mikrosatelitná PCR: 95 ° C (5 min.), 28x (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (20 s), 60 ° C (30 min.).
Separácia a vizualizácia produktov PCR sa uskutočňovala pomocou automatického analyzátora kapilárnej DNA ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabuľka 4. Charakteristiky 12 štandardných markerov SSR použitých na genotypizáciu P. Infestans (Li et al., 2013a)
názov | Počet alel | Rozsah veľkostí alely (bp) | Priméry |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAGAAAGGCTTC |
Ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Príklad vizualizácie výsledkov analýzy je uvedený na obr. 6. Výsledky sa analyzovali pomocou softvéru GeneMapper 3.7 porovnaním získaných údajov s údajmi známych izolátov. Na uľahčenie interpretácie výsledkov analýzy je potrebné do každej štúdie zahrnúť 1 - 2 referenčné izoláty so známym genotypom.
Navrhovaná výskumná metóda bola testovaná na značnom počte poľných vzoriek, po ktorých autori uskutočnili štandardizáciu protokolov medzi laboratóriami dvoch organizácií, James Hutton Institute (UK) a Wageningen University & Research (Holandsko), ktoré spolu s možnosťou použitia štandardných FTA kariet pre zjednodušenie zber a preprava vzoriek DNA P. infestans umožnili hovoriť o možnosti komerčného využitia tohto vývoja. Okrem toho rýchla a presná metóda genotypizácie izolátov P. infestans pomocou multiplexnej analýzy SSR umožnila uskutočniť štandardizované štúdie populácií tohto patogénu v globálnom meradle a vytvoriť svetovú databázu neskorých plesní v rámci projektu Eucablight (www.eucablight.org) vrátane , vrátane výsledkov mikrosatelitnej analýzy, umožnilo sledovať vznik a šírenie nových genotypov po celom svete.
Amplifikovaný polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (AFLP). AFLP (polymorfizmus dĺžky amplifikovaných fragmentov) je technológia na generovanie náhodných molekulárnych markerov pomocou špecifických primérov. V AFLP je DNA ošetrená kombináciou dvoch reštrikčných enzýmov. Na lepivé konce reštrikčných fragmentov sa ligujú špecifické adaptéry.
Tieto fragmenty sa potom amplifikujú s použitím primerov komplementárnych k sekvencii adaptéra a reštrikčnému miestu a dodatočne nesúcou jednu alebo viac náhodných báz na svojich 3 'koncoch. Sada získaných fragmentov závisí od reštrikčných enzýmov a náhodne vybraných nukleotidov na 3'-koncoch primérov (Vos et al., 1995). AFLP - genotypizácia sa používa na rýchle štúdium genetickej variácie rôznych organizmov.
Podrobný opis metódy je uvedený v prácach Muellera, Wolfenbargera, 1999, Savelkoula a kol., 1999. Mnoho práce porovnávajúcich rozlíšenie metód AFLP a SSR vykonali čínski vedci. Boli študované fenotypové a genotypové charakteristiky 48 izolátov P. infestans zozbieraných z piatich oblastí severnej Číny. Na základe AFLP spektier bolo identifikovaných osem rôznych genotypov DNA, na rozdiel od genotypov SSR, u ktorých nebola odhalená žiadna diverzita (Guo et al., 2008).
Amplifikácia primérmi homológnymi so sekvenciami mobilných prvkov
Markery odvodené zo sekvencií retrotranspozónov sú veľmi vhodné pre genetické mapovanie, štúdium genetickej diverzity a evolučných procesov (Schulman, 2006). Ak sa pripravia priméry na doplnenie stabilných sekvencií určitých mobilných prvkov, je možné amplifikovať oblasti genómu umiestnené medzi nimi. V štúdiách pôvodcu neskorej plesne sa úspešne použila metóda amplifikácie častí genómu pomocou priméru komplementárneho k jadrovej sekvencii SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) retropazónu (Lavrova a Elansky, 2003). Pri použití tejto metódy sa odhalili rozdiely dokonca aj u nepohlavných potomkov jedného izolátu. V tejto súvislosti sa dospelo k záveru, že metóda inter - SINE - PCR je veľmi špecifická a rýchlosť pohybu prvkov SINE v genóme Phytophthora je vysoká.
V genóme P. infestans bolo identifikovaných 12 rodín krátkych retrotranspozónov (SINE); skúmala sa druhová distribúcia krátkych retrotranspozónov, identifikovali sa prvky (SINE), ktoré sa nachádzajú v genóme iba P. infestans (Lavrova, 2004).
Vlastnosti aplikácie metód porovnávacej štúdie kmeňov v populačných štúdiách
Pri plánovaní štúdie je potrebné jasne pochopiť ciele, ktoré sleduje, a používať príslušné metódy. Niektoré metódy teda umožňujú generovať veľké množstvo nezávislých značkových značiek, ale súčasne majú nízku reprodukovateľnosť a silne závisia od použitých reagencií, reakčných podmienok a kontaminácie testovaného materiálu. Preto je pri každej štúdii skupiny kmeňov nevyhnutné použiť niekoľko štandardných (referenčných) izolátov, avšak aj v tomto prípade je veľmi ťažké kombinovať výsledky niekoľkých experimentov.
Táto skupina metód zahŕňa RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Po amplifikácii sa získa veľké množstvo DNA fragmentov rôznych veľkostí. Takéto techniky sa odporúča použiť, keď je potrebné ustanoviť rozdiely medzi úzko príbuznými kmeňmi (pôvodné potomstvo, mutanty divokého typu atď.), Alebo v prípadoch, keď sa vyžaduje podrobná analýza malej vzorky. Metóda AFLP sa teda široko používa v genetickom mapovaní P. infestans (van der Lee a kol., 1997) a v intrapopulačných štúdiách (Knapova, Gisi, 2002, Cooke a kol., 2003, Flier a kol., 2003). Takéto metódy sú nepraktické pri vytváraní databáz kmeňov, pretože je prakticky nemožné zjednotiť účtovanie výsledkov pri vykonávaní analýz v rôznych laboratóriách.
Napriek zdanlivej jednoduchosti a rýchlosti prevedenia (izolácia DNA bez dobrého prečistenia, amplifikácie, vizualizácie výsledkov) si táto skupina metód vyžaduje použitie špeciálnej metódy na dokumentáciu výsledkov: destilácia v polyakrylamidovom géli so značenými (rádioaktívne alebo luminiscenčnými) primermi a následné vystavenie svetlu alebo rádioaktívnemu materiálu. Bežné zobrazovanie na agarózovom géli s etídiumbromidom nie je pre tieto metódy všeobecne vhodné, pretože môže fúzovať veľké množstvo fragmentov DNA rôznych veľkostí.
Iné metódy vám naopak umožňujú generovať malý počet funkcií s veľmi vysokou reprodukovateľnosťou. Táto skupina zahŕňa štúdium mitochondriálnych haplotypov DNA (v Rusku sú zaznamenané iba dva haplotypy Ia a IIa), typy párenia (väčšina izolátov sa delí na 2 typy: A1 a A2, zriedka sa nachádza samooplodný SF) a spektrá izozýmu peptidázy (dva lokusy Pep1 a Pep2 , pozostávajúci z dvoch izozýmov) a glukózo-6-fosfátizomerázy (v Rusku nie je pre tento znak variabilita, hoci v iných krajinách sveta je zaznamenaný výrazný polymorfizmus). Tieto funkcie je vhodné použiť pri analýze zbierok, kompilácii regionálnych a globálnych databáz. V prípade analýzy izoenzýmov a haplotypov mitochondriálnej DNA je možné sa vôbec zaobísť bez štandardných kmeňov, zatiaľ čo pri analýze páriacich typov sú potrebné dva testovacie izoláty so známymi typmi párenia.
Reakčné podmienky a reagenty môžu ovplyvniť iba kontrast produktu na elektroforetograme; prejav artefaktov v týchto typoch štúdií je nepravdepodobný.
V súčasnosti predstavuje väčšinu populácií v európskej časti Ruska kmene obidvoch druhov párenia (tabuľka 6), medzi nimi sú aj izoláty mitochondriálnej DNA s typmi Ia a IIa (ďalšie typy mtDNA nájdené na svete sa v Rusku po roku 1993 nenašli). Spektrá izozýmov peptidázy sú reprezentované dvoma genotypmi v lokusu Pep1 (100/100, 92/92 a heterozygot 92/100 a genotyp 92/92 je extrémne zriedkavý (<0,3%)) a dvoma genotypmi v lokusu Pep 2 (100/100 , 112/112 a heterozygot 100/112, pričom genotyp 112/112 sa vyskytuje menej často ako 100/100, ale tiež pomerne často).
Po roku 6 (vymiznutie klonálnej línie US-1993) nebola v spektre izozýmov glukózo-1-fosfátizomerázy variabilita; všetky študované izoláty mali genotyp 100/100 (Elansky a Smirnov, 2002).
Tretia skupina metód umožňuje získať dostatočnú skupinu nezávislých znakových znakov s vysokou reprodukovateľnosťou. Dnes táto skupina zahŕňa sondu RFLP-RG57, ktorá produkuje 25-29 fragmentov DNA rôznych veľkostí. RFLP-RG57 možno použiť ako pri analýze vzoriek, tak aj pri zostavovaní databáz. Táto metóda je však oveľa nákladnejšia ako predchádzajúce, je časovo náročná a vyžaduje dostatočne veľké množstvo vysoko purifikovanej DNA. Preto je výskumník nútený obmedziť objem testovaného materiálu.
Vývoj RFLP-RG57 na začiatku 90. rokov minulého storočia významne zintenzívnil populačné štúdie pôvodcu neskorej plesne. Stal sa základom metódy založenej na výbere a analýze „klonálnych čiar“ (pozri nižšie). Spolu s RFLP-RG57 sa na identifikáciu klonálnych línií používajú párovací typ, DNA odtlačky prstov (metóda RFLP-RG57), spektrá izoenzýmov peptidázy a glukóza-6-fosfát izomerázy a typ mitochondriálnej DNA. Vďaka nemu sa ukázalo, al., 1994), nahradenie starých populácií novými (Drenth a kol., 1993, Sujkowski a kol., 1994, Goodwin a kol., 1995a), odhalilo klonálne línie prevládajúce v mnohých krajinách sveta. Štúdie ruských kmeňov pomocou tejto metódy preukázali vysoký genotypový polymorfizmus kmeňov európskej časti a monomorfizmus populácií ázijských a ďalekovýchodných častí Ruska (Elansky et al, 2001). A teraz táto metóda zostáva hlavnou v populačných štúdiách P. infestans. Jeho širokej distribúcii však bráni pomerne vysoká cena a pracovná náročnosť pri vykonávaní.
Ďalšou sľubnou technikou, ktorá sa zriedka používa v štúdiách s P. infestans, je analýza mikrosatelitných opakovaní (SSR). V súčasnosti je táto metóda široko používaná na izoláciu klonálnych línií. Na analýzu kmeňov sa často používali (a naďalej sa používajú) také fenotypové markérové znaky ako prítomnosť génov virulencie na odrodách zemiakov (Avdey, 1995, Ivanyuk a kol., 2002, Ulanova a kol., 2003) a rajčiaky. Gény virulencie k odrodám zemiakov už stratili svoju hodnotu ako markerové znaky pre populačné štúdie z dôvodu výskytu maximálneho (alebo blízkeho) počtu génov virulencie u prevažnej väčšiny izolátov. Súčasne sa gén virulencie T1 pre kultivary rajčiakov nesúci zodpovedajúci gén Ph1 stále úspešne používa ako markerový znak (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
V mnohých štúdiách sa ako marker používa rezistencia na fungicídy. Túto vlastnosť je nežiaduce používať v populačných štúdiách kvôli pomerne ľahkému vzhľadu mutácií rezistencie v klonálnych líniách po aplikácii fungicídov obsahujúcich metalaxyl- (alebo mefenoxam-). Napríklad sa ukázali významné rozdiely v úrovni rezistencie v klonálnej línii Sib1 (Elansky et al., 2001).
Preto sú párovací typ, peptidázové izozýmové spektrum, typ mitochondriálnej DNA, RFLP-RG57, SSR preferovanými markermi na vytváranie databáz a značenie kmeňov v zbierkach. Na porovnanie obmedzených vzoriek, ak je potrebné použiť maximálny počet znakových funkcií, môžete použiť AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (tabuľka 5). Malo by sa však pamätať na to, že tieto metódy sú slabo reprodukovateľné a v každom jednotlivom experimente (cyklus amplifikačnej elektroforézy) sa musí použiť niekoľko referenčných izolátov.
Tabuľka 5. Porovnanie rôznych metód výskumu kmeňov P. infestans
kritérium | TC | Isofer policajti | mtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | otáčka |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Množstvo informácií | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reprodukovateľnosť | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Možnosť artefaktov | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Štát | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intenzita práce | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Rýchlosť analýzy ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Poznámka: H - nízka, C - stredná, B - vysoká; НС * - intenzita práce je nízka pri použití agarózového gélu alebo automatického použitia
genotyp, stredný - destiláciou v polyakrylamidovom géli so značenými primérmi,
** - nepočítajúc čas strávený rastom mycélia na izoláciu DNA.
Štruktúra obyvateľstva
Klonálne čiary
Pri absencii rekombinácie alebo jej nevýznamného prínosu k štruktúre populácie sa populácia skladá z určitého počtu klonov, ktorých genetické výmeny sú mimoriadne zriedkavé.
V takýchto populáciách je informatívnejšie študovať nie frekvencie jednotlivých génov, ale frekvencie genotypov, ktoré majú spoločný pôvod (klonálne línie alebo klonálne línie) a líšia sa iba bodovými mutáciami. Populačné štúdie patogénu neskorej plesne a analýza klonálnych línií sa významne zrýchlili od príchodu metódy RFLP-RG57 na začiatku 90. rokov minulého storočia. Spolu s RFLP-RG57 sa na identifikáciu klonálnych línií používajú párovací typ, spektrá izoenzýmov peptidázy a glukóza-6-fosfát izomerázy a typ mitochondriálnej DNA. Charakteristiky najbežnejších klonálnych línií sú uvedené v tabuľke 6.
Klon US-1 dominoval populácii všade až do konca 80. rokov, potom ho začal nahradzovať inými klonmi a zmizol z Európy a Severnej Ameriky. Teraz sa nachádza na Ďalekom východe (Filipíny, Taiwan, Čína, Japonsko, Kórea, Koh a kol., 1994, Mosa a kol., 1993), v Afrike (Uganda, Keňa, Rwanda, Goodwin a kol., 1994, Vega-Sanchez et. al., 2000; Ochwo et al., 2002) a v Južnej Amerike (Ekvádor, Brazília, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Len v Austrálii neboli identifikované žiadne kmene patriace do línie US-1. Podľa všetkého prišli izoláty P. infestans do Austrálie s ďalšou migračnou vlnou (Goodwin, 1997).
Klon US-6 migroval zo severného Mexika do Kalifornie koncom 70. rokov a spôsobil tam epidémiu zemiakov a paradajok po 32 rokoch bez choroby. Pre svoju vysokú agresivitu vytlačil klon US-1 a začal dominovať na západnom pobreží USA (Goodwin et al., 1995a).
Genotypy US-7 a US-8 boli objavené v Spojených štátoch v roku 1992 a už v roku 1994 boli široko distribuované v Spojených štátoch a Kanade. Počas jednej poľnej sezóny je klon US-8 schopný takmer úplne vytesniť klon US-1 na zemiakových plochách pôvodne infikovaných oboma klonmi v rovnakej koncentrácii (Miller a Johnson, 2000).
Klony BC-1 až BC-4 boli identifikované v Britskej Kolumbii u malého počtu izolátov od Goodwina a kol., 1995b). Klon US-11 sa rozšíril v USA a nahradil US-1 na Taiwane. Klony JP-1 a EC-1 sú spolu s klonom US-1 bežné v Japonsku a Ekvádore (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 je klon, ktorý zvíťazil v Rusku na rozsiahlom území od moskovského regiónu po Sachalin. V moskovskom regióne bol objavený v roku 1993 a niektoré poľné populácie pozostávali hlavne z kmeňov tejto klonálnej línie, vysoko rezistentných na metalaxyl. Po roku 1993 sa prevalencia tohto klonu významne znížila. Mimo Uralu v rokoch 1997 - 1998 sa SIB-1 nachádzal všade, s výnimkou Khabarovského územia (tam je rozšírený klon SIB-2). Priestorové oddelenie klonov s rôznymi typmi párenia vylučuje pohlavný proces na Sibíri a na Ďalekom východe. V moskovskom regióne je na rozdiel od Sibíri populácia zastúpená mnohými klonmi; takmer každý izolát má jedinečný multilokusový genotyp (Elansky et al., 2001, 2015). Túto rozmanitosť nemožno vysvetliť iba dovozom kmeňov plesní z rôznych častí sveta s dovezeným semenným materiálom. Pretože sa oba typy párenia vyskytujú v populácii, je možné, že za jeho rozmanitosť môže aj rekombinácia. V Britskej Kolumbii sa teda predpokladá vznik genotypov BC-2, BC-3 a BC-4 v dôsledku hybridizácie klonov BC-1 a US-6 (Goodwin et al., 1995b). Je možné, že hybridné kmene sa vyskytujú v populáciách Moskvy. Napríklad kmene MO-4, MO-8 a MO-11 heterozygotné pre PEP lokus môžu byť hybridmi medzi kmeňmi MO-12, MO-21, MO-22, ktoré majú typ párovania A2 a homozygotné pre jednu alelu PEP lokusu a kmeňa. MO-8, majúci párovací typ A1 a homozygotný pre druhú alelu lokusu. A ak je to tak, a v moderných populáciách P. infestans existuje tendencia k zvýšeniu úlohy sexuálneho procesu, potom sa informačná hodnota analýzy multilokusových klonov zníži (Elansky et al., 2001, 2015).
Variácia klonálnych línií
Do 90. rokov 20. storočia bola vo svete rozšírená klonová línia US-1. Väčšinu poľnej a regionálnej populácie tvorili výlučne kmene s genotypom US-1. Pozorovali sa však aj rozdiely medzi izolátmi, najpravdepodobnejšie spôsobené mutačným procesom. Mutácie sa vyskytovali tak v jadrovej, ako aj v mitochondriálnej DNA a ovplyvňovali okrem iného hladinu rezistencie na fenylamidové lieky a počet génov virulencie. Čiary, ktoré sa líšia od pôvodných genotypov mutáciami, sú označené ďalšími číslami za bodkou za názvom pôvodného genotypu (napríklad mutantná línia US-1.1 klonálnej línie US-1). Fingerprintingové DNA línie US-1.5 a US-1.6 obsahujú doplnkové línie rôznych veľkostí (Goodwin et al., 1995a, 1995b); klonálna línia US-6.3 sa tiež líši od US-6 v jednej doplnkovej línii (Goodwin, 1997, tabuľka 7).
Pri štúdiu mitochondriálnej DNA sa zistilo, že v klonálnej línii US-1 sa nachádza iba mitochondriálna DNA typu 1b (Carter et al., 1990). Avšak pri štúdiu kmeňov tejto klonálnej línie z Peru a Filipín boli nájdené izoláty, ktorých typy mitochondriálnej DNA sa líšili od lb podľa prítomnosti inzercií a delécií (Goodwin, 1, Koh a kol., 1991).
Tabuľka 6. Multilokusové genotypy niektorých klonálnych línií P. infestans
názov | Typ párenia | Izozýmy | DNA odtlačky prstov | Typ MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Poznámka: * - žiadne údaje.
Tabuľka 7. Multilokusové genotypy a ich mutantné línie
názov | Typ párenia | | DNA odtlačky prstov (RG57) | poznámky | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Pôvodný genotyp 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutácia v PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutácia v RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutácia v RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutácia v RG57 a PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutácia v RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Pôvodný genotyp 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutácia v PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutácia v RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutácia v RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutácia v RG57 a PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutácia v RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Pôvodný genotyp 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutácia v RG57 |
Zmeny nastávajú aj v spektrách izozýmov. Spravidla sú spôsobené rozpadom organizmu, ktorý je pre tento enzým pôvodne heterozygotný, na homozygotný. V roku 1993 sme na plodoch rajčiaka identifikovali kmeň s charakteristikami charakteristickými pre US-1: odtlačky prstov RG57, typ mitochondriálnej DNA a genotyp 86/100 pre glukózo-6-fosfatizomerázu, ale bol homozygotný (100/100) pre prvý lokus peptidázy namiesto heterozygot 92/100 typický pre túto klonálnu líniu. Genotyp tohto kmeňa sme pomenovali MO-17 (tabuľka 6). Mutantné línie US-1.1 a US-1.4 sa tiež líšia od US-1 mutáciami na prvom mieste peptidázy (tabuľka 7).
Mutácie vedúce k zmenám v počte génov virulencie u odrôd zemiakov a paradajok sú celkom bežné. Boli zaznamenané medzi izolátmi klonálnej línie US-1 v populáciách z Holandska (Drenth a kol., 1994), Peru (Goodwin a kol., 1995a), Poľska (Sujkowski a kol., 1991), severnej Severnej Ameriky (Goodwin a kol., ., 1995b). Rozdiely v počte génov zemiakovej virulencie boli zaznamenané aj medzi izolátmi klonálnych línií US-7 a US-8 v Kanade a USA (Goodwin et al., 1995a), medzi izolátmi línie SIB-1 v ázijskej časti Ruska (Elansky et al, 2001. ).
V monoklonálnych poľných populáciách boli identifikované izoláty so silnými rozdielmi v hladinách rezistencie na fenylamidové lieky, ktoré všetky patrili do klonálnej línie Sib-1 (Elansky et al, 2001, tabuľka 1). Takmer všetky kmene klonálnej línie US-1 sú vysoko citlivé na metalaxyl, avšak vysoko rezistentné izoláty tejto línie boli izolované na Filipínach (Koh et al., 1994) a v Írsku (Goodwin et al., 1996).
Moderné populácie P. infestans
Stredná Amerika (Mexiko)
Populácia P. infestans v Mexiku sa výrazne líši od ostatných svetových populácií, čo je primárne dôsledkom jeho historickej polohy. Početné štúdie o tejto populácii a príbuzných druhoch kmeňa Phytophthora druhu P. infestans, ako aj o miestnych druhoch rodu Solanum, viedli k záveru, že vývoj patogénu v centrálnej časti Mexika prebiehal spolu s vývojom hostiteľských rastlín a bol spojený so sexuálnou rekombináciou (Grünwald, Flier , 2005). Oba typy párenia sú zastúpené v populácii a v rovnakom pomere a prítomnosť oospór v pôde, na rastlinách a hľuzách zemiakov a s divo rastúcimi príbuznými druhmi Solanum potvrdzuje prítomnosť pohlavného procesu v populácii (Fernández-Pavía et al., 2002). Posledné štúdie o údolí Toluca a jeho okolí (predpokladanom centre pôvodu patogénu) potvrdili vysokú genetickú diverzitu miestnej populácie P. infestans (134 multilokusových genotypov vo vzorke 176 vzoriek) a prítomnosť niekoľkých diferencovaných subpopulácií v regióne (Wang et al., 2017). Faktory prispievajúce k tejto diferenciácii sú priestorové rozdelenie subpopulácií charakteristických pre vysočiny stredného Mexika, rozdiely v kultivačných podmienkach a odrodách zemiakov používaných v údoliach a horách a prítomnosť divo rastúcich hľuznatých druhov Solanum, ktoré môžu pôsobiť ako alternatívni hostitelia (Fry et al.) ., 2009).
Je však potrebné poznamenať, že populácie P. infestans v severnom Mexiku sú skôr klonálne a viac podobné populáciám Severnej Ameriky, čo môže naznačovať, že sa jedná o nové genotypy (Fry et al., 2009).
Severná Amerika
Populácie P. infestans v Severnej Amerike mali vždy veľmi jednoduchú štruktúru a ich klonálny charakter sa zistil dávno pred použitím mikrosatelitnej analýzy. Do roku 1987 dominovala v USA a Kanade klonová línia US-1 (Goodwin et al., 1995). V polovici 70. rokov, keď sa objavili fungicídy na báze metalaxylu, začal byť tento klon nahradený inými, odolnejšími genotypmi, ktoré migrovali z Mexika (Goodwin et al., 1998). Koncom 90. rokov. genotyp US-8 úplne nahradil genotyp US-1 v USA a stal sa dominantnou klonálnou líniou na zemiakoch (Fry a kol., 2009; Fry a kol., 2015). Iná situácia bola u paradajok, ktoré neustále obsahovali niekoľko klonálnych línií a ich zloženie sa z roka na rok menilo (Fry et al., 2009).
V roku 2009 vypukla v USA rozsiahla epidémia neskorej plesne na rajčiakoch. Charakteristickým znakom tejto pandémie bol jej takmer súčasný nástup na mnohých miestach severovýchodných USA a ukázalo sa, že to bolo spojené s masívnym predajom infikovaných sadeníc paradajok vo veľkých záhradných centrách (Fry et al., 2013). Straty na úrode boli obrovské. Mikrosatelitná analýza postihnutých vzoriek odhalila, že pandemický kmeň patril do klonálnej línie párenia typu US-22 A2. V roku 2009 dosiahol podiel tohto genotypu na americkej populácii P. infestans 80% (Fry et al., 2013). V nasledujúcich rokoch sa podiel agresívnych genotypov US-23 (hlavne na rajčiakoch) a US-24 (na zemiakoch) v populácii neustále zvyšoval, avšak po roku 2011 sa miera detekcie US-24 významne znížila a do dnešného dňa asi 90% populácie patogénov v USA predstavuje genotyp US-23 (Fry et al., 2015).
V Kanade, rovnako ako v USA, na konci 90. rokov. dominantný genotyp US-1 bol nahradený US-8, ktorého dominantné pozície sa až do roku 2008 nezmenili. V Kanade sa vyskytli vážne epidémie neskorej plesne spojené s predajom infikovaných sadeníc paradajok, boli však spôsobené genotypmi US-2009 a US-2010 (Kalischuk et al., 23). Jasná geografická diferenciácia týchto genotypov bola pozoruhodná: USA-8 dominovali v západných provinciách Kanady (2012%), zatiaľ čo USA-23 dominovali vo východných provinciách (68%). V nasledujúcich rokoch sa US-8 rozšíril do východných oblastí; jeho podiel na populácii sa však všeobecne mierne znížil na pozadí výskytu genotypov US-83 a US-23 v krajine (Peters et al., 22). USA-24 si dodnes udržujú dominantné postavenie v celej Kanade; US-2014 je prítomný v Britskej Kolumbii, zatiaľ čo US-23 a US-8 sú prítomné v Ontáriu (Peters, 23).
Severoamerické populácie P. infestans sú teda hlavne klonálnymi líniami. Za posledných 40 rokov dosiahol počet detegovaných klonálnych genotypov 24. Napriek skutočnosti, že sa v populácii vyskytujú kmene oboch typov párenia, pravdepodobnosť výskytu nových genotypov v dôsledku sexuálnej rekombinácie zostáva pomerne nízka. Napriek tomu bolo za posledných 20 rokov zaznamenaných niekoľko prípadov výskytu efemérnych rekombinantných populácií (Gavino a kol., 2000; Danies a kol., 2014; Peters a kol., 2014) a v jednom prípade bol výsledkom kríženia genotyp US-11. , ktorá bola zakotvená v Severnej Amerike už mnoho rokov (Gavino et al., 2000). Do roku 2009 boli zmeny v štruktúre populácií spojené so vznikom nových, agresívnejších genotypov s ich následnou migráciou a vytesňovaním predtým dominantných predchodcov. Čo sa stalo v rokoch 2009 - 2010 V USA a Kanade epifytotiká po prvýkrát ukázali, že v ére globalizácie môžu byť ohniská choroby spojené s aktívnym šírením nových genotypov pri predaji infikovaného sadivového materiálu.
Južná Amerika
Až donedávna neboli štúdie juhoamerických populácií P. infestans pravidelné ani rozsiahle. Je známe, že štruktúra týchto populácií je dosť jednoduchá a zahŕňa 1-5 klonálnych línií na krajinu (Forbes et al., 1998). Takže do roku 1998 sa genotypy US-1 (Brazília, Čile) BR-1 (Brazília, Bolívia, Uruguaj, Paraguay), EC-1 (Ekvádor, Kolumbia, Peru a Venezuela), AR-1, AR našli na zemiakoch -2, AR-3, AR-4 a AR-5 (Argentína), PE-3 a PE-7 (južné Peru). Krytie typu A2 sa vyskytovalo v Brazílii, Bolívii a Argentíne a nenašlo sa za bolívijsko-peruánskou hranicou v oblasti jazera Titicaca, za ktorým v Andách dominoval genotyp EC-1 A1. U paradajok zostal US-1 dominantným genotypom v celej Južnej Amerike.
Situácia viac-menej pretrvávala v 2000. rokoch 2. storočia. Dôležitým bodom bol objav v severných Andách na voľne rastúcich príbuzných zemiakov (S. brevifolium a S. tetrapetalum) novej klonálnej línie EC-2 typu A2010 (Oliva et al., 3). Fylogenetické štúdie preukázali, že táto línia nie je úplne identická s P. infestans, aj keď s ňou úzko súvisí, v súvislosti s ktorou sa navrhovalo uvažovať o nej, ako aj ďalšia línia EC-2013 izolovaná z rajčiaka S. betaceum rastúceho v Andách, nový druh s názvom P. andina; stav tohto druhu (nezávislý druh alebo hybrid P. infestans s nejakou stále neznámou líniou) je však stále nejasný (Delgado et al., XNUMX).
V súčasnosti sú všetky juhoamerické populácie P. infestans klonálne. Napriek prítomnosti oboch typov párenia neboli identifikované žiadne rekombinantné populácie. Pokiaľ ide o paradajky, genotyp US-1 je všadeprítomný, zjavne vytlačený zo zemiakov miestnymi kmeňmi, ktorých presný pôvod je stále neznámy. V Brazílii, Bolívii a Uruguaji je prítomný genotyp BR-1; v Peru existuje spolu s US-1 a EC-1 aj niekoľko ďalších miestnych genotypov. V Andách si dominantné postavenie zachováva klonálna línia EC-1, ktorej vzťah s nedávno objavenou P. andina zostáva nepreskúmaný. Jediné „nestabilné“ miesto, kde sa na obdobie rokov 2003 - 2013 nachádza. došlo k významným zmenám v populácii, sa stal Chile (Acuña et al., 2012), kde v rokoch 2004-2005. populácia patogénov sa stala charakteristickou pre rezistenciu na metalaxyl a nový haplotyp mitochondriálnej DNA (la namiesto predtým prítomného Ib). 2006 až 2011 V populácii dominoval genotyp 21 (podľa SSR), ktorého podiel dosiahol 90%, potom dlaň prešla na genotyp 20, ktorého frekvencia výskytu sa v nasledujúcich dvoch rokoch udržala na úrovni približne 67% (Acuña, 2015).
Európa
V histórii Európy sa vyskytli najmenej dve migračné vlny P. infestans zo Severnej Ameriky: v 1. storočí. (HERB-1) a začiatkom 70. storočia (US-1). Všadeprítomná distribúcia fungicídov obsahujúcich metalaxyl v XNUMX. rokoch. viedlo k vytlačeniu dominantného genotypu US-XNUMX a jeho nahradeniu novými genotypmi. Výsledkom bolo, že vo väčšine krajín západnej Európy boli populácie patogénu zastúpené hlavne niekoľkými klonálnymi líniami.
Použitie mikrosatelitnej analýzy na analýzu populácií patogénov umožnilo identifikovať vážne zmeny, ku ktorým došlo v západnej Európe v rokoch 2005 - 2008. V roku 2005 bola vo Veľkej Británii objavená nová klonálna línia s názvom 13_A2 (alebo „modrá 13“), ktorá sa vyznačuje typom párenia A2. , vysoká agresivita a odolnosť voči fenylamidom (Shaw et al., 2007). Rovnaký genotyp sa našiel vo vzorkách odobratých v roku 2004 v Holandsku a severnom Francúzsku, čo naznačuje, že do Veľkej Británie migroval z kontinentálnej Európy, pravdepodobne so sadivom zemiakov (Cooke et al., 2007). Štúdium genómu zástupcov tejto klonálnej línie preukázalo vysoký stupeň polymorfizmu jeho sekvencie (do roku 2016 počet jeho subklonálnych variácií dosiahol 340) a značný stupeň variácií v úrovni génovej expresie, vč. efektorové gény počas infekcie rastlín (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Tieto vlastnosti, spolu so zvýšeným trvaním biotrofickej fázy, by mohli spôsobiť zvýšenú agresivitu 13_A2 a jej schopnosť infikovať aj odrody zemiakov odolné proti neskorej plesni.
V nasledujúcich rokoch sa genotyp rýchlo rozšíril do krajín severozápadnej Európy (Veľká Británia, Írsko, Francúzsko, Belgicko, Holandsko, Nemecko) so súčasným vytesnením predtým dominantných genotypov 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Podľa webovej stránky www.euroblight.net dosiahol podiel 13_A2 v populáciách týchto krajín 60 - 80% a viac; prítomnosť tohto genotypu bola zaznamenaná aj v niektorých krajinách východnej a južnej Európy. Avšak v rokoch 2009-2012. 13_A2 stratila svoje dominantné postavenie vo Veľkej Británii a Francúzsku, čím sa podriadila línii 6_A1 (8_A1 v Írsku), a v Holandsku a Belgicku bola čiastočne nahradená genotypmi 1_A1, 6_A1 a 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
K dnešnému dňu je asi 70% západoeurópskej populácie P. infestans monoklonálna. Podľa webovej stránky www.euroblight.net sú dominantné genotypy v krajinách severozápadnej Európy (Spojené kráľovstvo, Francúzsko,
Holandsko, Belgicko) zostávajú približne v rovnakých pomeroch 13_A2 a 6_A1 a druhá sa prakticky nevyskytuje mimo špecifikovaného regiónu (s výnimkou Írska), ale má už najmenej 58 subklonov (Cooke, 2017). V Nemecku sú variácie 13_A2 v zjavnom množstve a sporadicky ich možno pozorovať aj v krajinách strednej a južnej Európy. Genotyp 1_A1 tvorí významnú časť populácie Belgicka a čiastočne Holandska a Francúzska. Genotyp 8_A1 sa stabilizoval v európskej populácii na úrovni 3 - 6%, s výnimkou Írska, kde si zachováva svoje vedúce postavenie a je rozdelený do dvoch subklonov (Stellingwerf, 2017). Nakoniec bol v roku 2016 zaznamenaný nárast frekvencie výskytu nových genotypov 36_A2 a 37_A2, prvýkrát zaznamenaný v rokoch 2013 - 2014; tieto genotypy sa dodnes vyskytujú v Holandsku a Belgicku a čiastočne vo Francúzsku a Nemecku, ako aj v južnej časti Veľkej Británie (Cooke, 2017). Približne 20 - 30% západoeurópskej populácie predstavuje každý rok jedinečné genotypy.
Na rozdiel od západnej Európy, v čase, keď sa objavil genotyp 13_A2, populácie severnej Európy (Švédsko, Nórsko, Dánsko, Fínsko) neboli zastúpené klonálnymi líniami, ale veľkým počtom jedinečných genotypov (Brurberg et al.,
2011). Počas obdobia aktívneho šírenia 13_A2 v západnej Európe bola prítomnosť tohto genotypu v Škandinávii zaznamenaná až v roku 2011, keď bol prvýkrát objavený v Severnom Jutsku (Dánsko), kde sa pestujú hlavne priemyselné odrody zemiakov s aktívnym využitím metalaxylu obsahujúceho fungicídy (Nielsen et al., 2014). Podľa www.euroblight.net bol genotyp 13_A2 detekovaný aj v niekoľkých vzorkách z Nórska a Dánska v roku 2014 a vo viacerých nórskych vzorkách v roku 2016; okrem toho bola v roku 2013 vo Fínsku zaznamenaná prítomnosť genotypu 6_A1 v malom množstve. Za hlavný dôvod zlyhania 13_A2 a ďalších klonálnych línií pri dobytí Škandinávie sa považujú klimatické rozdiely tohto regiónu od krajín západnej Európy.
Okrem toho, že chladné letá a chladné zimy podporujú prežitie ani nie tak vegetatívneho mycélia ako oospór (Sjöholm et al., 2013), zamrznutie pôdy v zime (ktoré sa zvyčajne v teplejších krajinách západnej Európy nevyskytuje) prispieva k synchronizácii klíčenia a výsadby oospór. zemiaky, čo zvyšuje ich úlohu ako zdroja primárnej infekcie (Brurberg et al., 2011). Je tiež potrebné poznamenať, že v severných podmienkach vývoj infekcie z oospór prekonáva vývoj hľuzovej infekcie, čo v konečnom dôsledku bráni dominancii ešte agresívnejších, ale neskôr vyvinutých klonálnych línií (Yuen, 2012). Štruktúra najštudovanejších populácií P. infestans v krajinách východnej Európy (Poľsko, pobaltské štáty) je veľmi podobná štruktúre v Škandinávii.
Tiež sú tu prítomné oba typy párenia a veľká väčšina genotypov určených analýzou SSR je jedinečná (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Rovnako ako v severnej Európe, šírenie klonálnych línií (predovšetkým genotypu 13_A2) prakticky neovplyvnilo miestne populácie patogénu, ktoré si zachovávajú vysokú úroveň diverzity pri absencii výrazných dominantných línií.
Na poliach s komerčnými odrodami zemiakov sa príležitostne pozoruje prítomnosť 13_A2. V Rusku sa situácia vyvíja podobným spôsobom. Mikrosatelitná analýza izolátov P. infestans zhromaždených v rokoch 2008 - 2011 v 10 rôznych regiónoch európskej časti Ruska vykazovali vysoký stupeň genotypovej diverzity a úplný nedostatok náhod s európskymi klonálnymi líniami (Statsyuk et al., 2014). O niekoľko rokov neskôr štúdia vzoriek P. infestans odobratých v Leningradskej oblasti v rokoch 2013 - 2014 preukázala významné rozdiely medzi nimi a genotypmi z tejto oblasti identifikovanými v predchádzajúcej štúdii. V oboch štúdiách sa nezistili žiadne západoeurópske genotypy (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Vysoká genetická diverzita východoeurópskych populácií P. infestans a absencia dominantných klonálnych línií v nich môže byť spôsobená niekoľkými dôvodmi. Po prvé, rovnako ako v severnej Európe, klimatické podmienky uvažovaných krajín prispievajú k vzniku oospór ako primárneho zdroja infekcie (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Po druhé, značná časť zemiakov vypestovaných v týchto krajinách sa pestuje na malých súkromných farmách, ktoré sú často obklopené lesmi alebo inými prekážkami brániacimi voľnému pohybu infekčného materiálu (Chmielarz et al., 2014). Spravidla sa zemiaky pestované v takýchto podmienkach prakticky neošetria chemickými látkami a výber odrôd je založený na ich odolnosti voči neskorej plesni, t.j. neexistuje žiadny selektívny tlak na agresivitu a rezistenciu na metalaxyl, ktorý zbavuje rezistentné genotypy, ako napríklad 13_A2, výhod oproti iným genotypom (Chmielarz et al., 2014). Nakoniec, z dôvodu malých rozmerov pozemkov ich majitelia zvyčajne nepraktizujú striedanie plodín a pestujú zemiaky na rovnakom mieste už roky, čo prispieva k hromadeniu geneticky rozmanitého inokula (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Ázie
Štruktúra populácií P. infestans v Ázii bola donedávna pomerne zle pochopená. Bolo známe, že je reprezentovaná hlavne klonálnymi líniami a vplyv sexuálnej rekombinácie na vznik nových genotypov je veľmi malý. Teda napríklad v rokoch 1997-1998. V ázijskej časti Ruska (Sibír a Ďaleký východ) predstavovali populáciu patogénov iba tri genotypy s prevahou genotypu SIB-1 (Elansky et al., 2001). Prítomnosť klonálnych patogénnych línií sa preukázala v krajinách ako Čína, Japonsko, Kórea, Filipíny a Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Klonálna línia US-1, ktorá dominovala nad veľkým územím Ázie, koncom 90. rokov - začiatkom 2000. rokov. takmer všade začali byť nahradzované inými genotypmi, ktoré naopak ustupovali novým. Vo väčšine prípadov boli zmeny v štruktúre a zložení populácií v ázijských krajinách spojené s migráciou nových genotypov zvonku. Takže v Japonsku, s výnimkou genotypu JP-3, všetky ostatné japonské genotypy, ktoré sa objavili po US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), majú viac alebo menej dokázaný vonkajší pôvod (Akino et al., 2011) ... V Číne v súčasnosti existujú tri hlavné populácie patogénov s jasným geografickým rozdelením; Medzi týmito populáciami nie je žiadny alebo veľmi slabý tok génov (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotyp 13_A2 sa objavil na území Číny v jej južných provinciách (Yunnan a Sichuan) v rokoch 2005-2007 a v rokoch 2012-1014. bol pozorovaný aj na severovýchode krajiny (Li et al., 2013b). V Indii sa 13_A2 objavil pravdepodobne súčasne s Čínou, najpravdepodobnejšie s infikovaným sadivom zemiakov (Chowdappa et al., 2015), a v rokoch 2009 - 2010. spôsobila vážne paradajkové ochorenie neskorej plesne na rajčiakoch na juhu krajiny, potom sa rozšírila na zemiaky a v roku 2014 spôsobila epidémiu neskorej plesne v Západnom Bengálsku, čo viedlo k záhube a samovražde mnohých miestnych farmárov (Fry, 2016).
Африка
Do roku 2008-2010 systematické štúdie P. infestans v afrických krajinách sa neuskutočnili. V súčasnosti možno africké populácie P. infestans rozdeliť do dvoch skupín a toto rozdelenie je jednoznačne spojené so skutočnosťou dovozu sadiva zemiakov z Európy.
V severnej Afrike, ktorá aktívne dováža sadbové zemiaky z Európy, je typ párenia A2 široko zastúpený takmer vo všetkých regiónoch, čo poskytuje teoretickú možnosť vzniku nových genotypov v dôsledku sexuálnej rekombinácie (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Okrem toho je v Alžírsku zaznamenaná prítomnosť genotypov 13_A2, 2_A1 a 23_A1 s výraznou dominanciou prvého z nich, ako aj s postupným znižovaním podielu jedinečných genotypov na úplnom zmiznutí (Rekad et al., 2017). Na rozdiel od zvyšku regiónu, v Tunisku (s výnimkou severovýchodu krajiny) je populácia patogénov zastúpená hlavne párením typu A1 (Harbaoui et al., 2014).
Klonálna línia NA-01 je tu dominantná. Vo všeobecnosti je podiel klonálnych línií v populácii iba 43%. Vo východnej a južnej Afrike, kde sú objemy dovozu osiva mizivo malé (Fry et al., 2009), je P. infestans reprezentovaný iba dvoma klonálnymi líniami typu A1, US-1 a KE-1, a druhý aktívne premiestňuje prvý na zemiakoch ( Pule a kol., 2012; Njoroge a kol., 2016). K dnešnému dňu majú oba tieto genotypy znateľný počet subklonálnych variácií.
Austrália
Prvá správa o neskorej plesni na zemiakoch v Austrálii pochádza z roku 1907 a prvé epifytózy, pravdepodobne spôsobené silnými dažďami v letných mesiacoch, sa vyskytli v rokoch 1909-1911. (Drenth a kol., 2002). Všeobecne však platí, že neskorá pleseň nemá pre krajinu žiadny významný ekonomický význam. Sporadické ohniská neskorej plesne vyvolané poveternostnými podmienkami, ktoré poskytujú vysokú vlhkosť, sa vyskytujú nie viac ako raz za 5-7 rokov a sú lokalizované hlavne v severnej Tasmánii a strednej Viktórii. V súvislosti s uvedeným prakticky absentujú publikácie venované štúdiu štruktúry austrálskej populácie P. infestans. Posledné dostupné informácie sú z rokov 1998-2000. (Drenth a kol., 2002). Podľa autorov bola populácia Viktórie klonálnou líniou US-1.3, ktorá nepriamo potvrdila migráciu tohto genotypu zo Spojených štátov. Tasmánske exempláre boli klasifikované ako AU-3, odlišné od genotypov prítomných v tom čase v iných častiach sveta.
Vlastnosti vývoja neskorej plesne v Rusku
V Európe sa infekcia zavádza chorými hľuzami semien, oporami, ktoré prezimovali v pôde, ako aj zoosporangiami, ktoré priniesol vietor z rastlín vypestovaných z prezimovaných hľúz na minuloročných poliach („dobrovoľnícke“ rastliny) alebo na hromadách vyradených rastlín. záložka na skladovanie hľúz. Z nich sú rastliny pestované na hromadách vyradených hľúz považované za najnebezpečnejší zdroj infekcie. tam je počet naklíčených hľúz často značný a zoosporangia sa z nich dá preniesť na veľké vzdialenosti. Zvyšok zdrojov (oospory, „dobrovoľné“ rastliny) nie je taký nebezpečný, pretože nie je zvykom pestovať rastliny na rovnakých poliach častejšie ako raz za 3-4 roky. Infekcia chorými hľuzami osiva je tiež minimálna vďaka dobrému systému kontroly kvality osiva.
Všeobecne je množstvo inokula v európskych populáciách obmedzené, a preto je nárast epidémie pomerne pomalý a dá sa úspešne regulovať pomocou chemických fungicídnych prípravkov. Hlavnou úlohou v európskych podmienkach je boj proti infekcii vo fáze, keď sa začína hromadné rozširovanie zoosporangií z infikovaných rastlín.
V Rusku je situácia radikálne odlišná. Väčšina plodín zemiakov a paradajok sa pestuje v malých súkromných záhradách; ochranné opatrenia sa na nich buď nevykonávajú vôbec, alebo sa fungicídne ošetrenie vykonáva v nedostatočnom počte a začína sa po výskyte neskorej plesne na vrcholoch. Výsledkom je, že súkromné zeleninové záhrady pôsobia ako hlavný zdroj infekcie, z ktorej sa zoosporangia prenáša vetrom na komerčné výsadby. To potvrdzujú aj naše priame pozorovania v regiónoch Moskva, Brjansk, Kostroma a Rjazaň: poškodenie rastlín v súkromných záhradách sa pozoruje ešte pred začiatkom fungicídneho ošetrenia komerčných výsadieb. Následne je epidémia na veľkých poliach potlačená použitím fungicídnych prípravkov, zatiaľ čo v súkromných záhradách dochádza k rýchlemu rozvoju neskorej plesne.
V prípade nesprávneho alebo „rozpočtového“ zaobchádzania s komerčnými výsadbami sa na poliach objavujú ohniská neskorej plesne; neskôr sa aktívne rozvíjajú a pokrývajú čoraz väčšie oblasti (Elansky, 2015). Infekcia v súkromných záhradách má významný vplyv na epidémie v komerčných oblastiach. Vo všetkých ruských pestovateľských regiónoch je plocha zemiakov v súkromných záhradách niekoľkonásobne väčšia ako celková plocha polí veľkých producentov. V takomto prostredí možno súkromné zeleninové záhrady považovať za globálny zdroj inokula pre komerčné polia. Pokúsme sa identifikovať tie vlastnosti, ktoré sú charakteristické pre genotypy kmeňov v súkromných záhradách.
Výsadba neosivných a karanténnych kontrol konzumných zemiakov, paradajkových semien získaných od pochybných zahraničných výrobcov, dlhodobé pestovanie zemiakov a paradajok na rovnakých plochách, nesprávne fungicídne ošetrenie alebo ich úplná absencia vedú k silným epifytotomám v súkromnom sektore, ktorých výsledok je zadarmo kríženie, hybridizácia a tvorba oospór v súkromných záhradách. Vo výsledku sa pozoruje veľmi vysoká genotypová diverzita patogénu, keď je takmer každý kmeň jedinečný svojím genotypom (Elansky et al., 2001, 2015). Pri výsadbe sadiva zemiakov rôzneho genetického pôvodu je nepravdepodobné, že sa objavia klonálne línie špecializované na napadnutie konkrétnej odrody. Kmene vybrané v takom prípade sa vyznačujú všestrannosťou vo vzťahu k postihnutým odrodám, väčšina z nich má blízko k maximálnemu počtu génov virulencie. To sa veľmi líši od systému „klonálnych línií“ typických pre veľké polia poľnohospodárskych podnikov so správne nainštalovaným systémom ochrany proti neskorej plesni. „Klonálne línie“ (keď sú všetky kmene patogénu neskorej plesne v teréne zastúpené jedným alebo viacerými genotypmi) sú všadeprítomné v krajinách, kde sa pestovanie zemiakov uskutočňuje výhradne na veľkých farmách: USA, Holandsko, Dánsko atď. V Anglicku, Írsku, Poľsku, kde sú tradične rozšírené aj pozemky pre domácnosť. pri pestovaní zemiakov existuje vyššia genotypová rozmanitosť aj v súkromných záhradách. Na konci 20. storočia boli „klonálne línie“ rozšírené v ázijských a ďalekovýchodných častiach Ruska (Elansky et al., 2001), čo je zjavne spôsobené používaním rovnakých odrôd zemiakov výlučne na pestovanie. Nedávno sa situácia v týchto regiónoch začala meniť aj smerom k nárastu genotypovej rozmanitosti populácií.
Nedostatok intenzívneho ošetrenia fungicídnymi prípravkami má ďalší priamy dôsledok - v záhradách nehromadí rezistentné kmene. Naše výsledky skutočne ukazujú, že kmene rezistentné na metalaxyl sa vyskytujú oveľa menej často v súkromných záhradách ako v komerčných výsadbách.
Tesná blízkosť výsadby zemiakov a paradajok, typická pre súkromné záhrady, uľahčuje migráciu kmeňov medzi týmito plodinami, v dôsledku čoho sa v poslednom desaťročí medzi kmeňmi izolovanými zo zemiakov nachádza podiel kmeňov, ktoré nesú gén rezistencie na odrody cherry paradajok (T1), predtým charakteristický iba pre paradajkové „kmene. Kmene s génom T1 sú vo väčšine prípadov veľmi agresívne voči zemiakom aj paradajkam.
V posledných rokoch sa neskorá pleseň na paradajkách začala objavovať v mnohých prípadoch skôr ako na zemiakoch. Sadenice rajčiakov môžu byť napadnuté oospórami v pôde alebo oospórami prítomnými v semenách rajčiakov alebo na nich prilnúť (Rubin et al., 2001). Za posledných 15 rokov sa v obchodoch objavilo veľké množstvo lacných balených semien, hlavne dovážaných, a väčšina malých výrobcov prešla na ich používanie. Semená môžu obsahovať kmene s genotypmi typickými pre oblasti ich kultivácie. V budúcnosti budú tieto genotypy zahrnuté do sexuálneho procesu v súkromných záhradách, čo vedie k vzniku úplne nových genotypov.
Možno teda konštatovať, že súkromné záhrady sú globálnym „taviacim kotlom“, v ktorom sa v dôsledku výmeny genetického materiálu spracúvajú existujúce genotypy a objavujú sa úplne nové. Okrem toho sa ich výber uskutočňuje v podmienkach, ktoré sa veľmi líšia od podmienok vytvorených pre zemiaky na veľkých farmách: absencia fungicídneho lisu, odrodová uniformita výsadby, prevaha rastlín postihnutých rôznymi formami vírusovej a bakteriálnej infekcie, blízkosť paradajok a divých nočných tieňov, aktívne kríženie a tvorba oospór, možnosť aby oospory pôsobili ako zdroj infekcie pre nasledujúci rok.
To všetko vedie k veľmi vysokej genotypovej rozmanitosti populácií záhradky. Za epifytotických podmienok sa neskorá pleseň šíri veľmi rýchlo v zeleninových záhradách a uvoľňuje sa obrovské množstvo spór, ktoré odlietajú do blízkych komerčných výsadieb. Po vstupe do obchodných oblastí so správnym systémom poľnohospodárskej technológie a chemickej ochrany však spor, ktoré sa dostali, nemá prakticky žiadnu príležitosť iniciovať epifytotiku v tejto oblasti, čo je spôsobené absenciou klonálnych línií rezistentných voči fungicídom a špecializovaných na kultivovanú odrodu.
Ďalším zdrojom primárneho inokula môžu byť choré hľuzy zachytené v komerčných sadeniciach. Tieto hľuzy sa pestovali spravidla na poliach s dobrou poľnohospodárskou technológiou a intenzívnou chemickou ochranou. Genotypy izolátov, ktoré ovplyvnili hľuzy, sú prispôsobené vývoju ich vlastnej odrody. Tieto kmene sú pre komerčnú výsadbu podstatne nebezpečnejšie ako inokulum pochádzajúce zo súkromných záhrad. Výsledky našich štúdií tiež podporujú tento predpoklad. Populácie izolované z veľkých polí so správne vykonanou chemickou ochranou a dobrou poľnohospodárskou technológiou sa nelíšia vo vysokej genotypovej diverzite. Často ide o niekoľko klonálnych línií, ktoré sú vysoko agresívne.
Kmene z komerčného semenného materiálu môžu vstúpiť do populácie v zeleninových záhradách a zapojiť sa do procesov, ktoré v nich prebiehajú. Avšak v zeleninovej záhrade bude ich konkurencieschopnosť oveľa nižšia ako v komerčnej oblasti a čoskoro prestanú existovať v podobe klonálnej línie, ale ich gény sa dajú využiť v „záhradnej“ populácii.
Infekcia, ktorá sa vyvinie na „dobrovoľných“ rastlinách a na hromadách vyradených hľúz počas zberu, nie je pre Rusko taká dôležitá, pretože V hlavných regiónoch Ruska, v ktorých sa pestujú zemiaky, sa pozoruje hlboké zimné zamrznutie pôdy a rastliny z hľúz, ktoré zimovali v pôde, sa vyvíjajú zriedka. Ako navyše ukazujú naše experimenty, patogén neskorej plesne neprežije pri negatívnych teplotách ani na hľuzách, ktoré si zachovali svoju životaschopnosť. V suchých zónach, kde sa praktizuje pestovanie skorých zemiakov, je neskorá pleseň pomerne suchá kvôli suchému a teplému vegetačnému obdobiu.
V súčasnosti teda pozorujeme rozdelenie populácií P. infestans na „poľné“ a „záhradné“ populácie. V posledných rokoch však boli pozorované procesy vedúce ku konvergencii a interpenetrácii genotypov z týchto populácií.
Medzi nimi možno spomenúť všeobecné zvýšenie gramotnosti malých výrobcov, vznik cenovo dostupných malých balení sadiva zemiakov, šírenie fungicídnych prípravkov v malých baleniach a strata strachu z „chémie“ obyvateľstva.
Nastávajú situácie, keď sú vďaka intenzívnej činnosti jedného dodávateľa vysadené celé dediny semennými hľuzami rovnakej odrody a sú opatrené malými baleniami rovnakých pesticídov. Dá sa predpokladať, že zemiaky rovnakej odrody sa nachádzajú na komerčných výsadbách v okolí.
Na druhej strane niektoré spoločnosti obchodujúce s pesticídmi propagujú „rozpočtové“ schémy chemického ošetrenia. V takom prípade je počet odporúčaných ošetrení podceňovaný a sú ponúkané najlacnejšie fungicídy. Dôraz sa nekladie na zabránenie vzniku neskorej plesne až po kosenie vrcholov, ale na určité oneskorenie epifytotypu s cieľom zvýšiť úrodu. Takéto schémy sú ekonomicky opodstatnené pri pestovaní konzumných zemiakov z menej kvalitného semenného materiálu, keď v zásade nejde o získanie vysokého výnosu. Avšak v tomto prípade, na rozdiel od záhradných populácií, vyrovnané genetické pozadie zemiakov prispieva k výberu špecifických fyziologických rás, ktoré sú pre túto odrodu veľmi nebezpečné.
Všeobecne sa nám tendencie konvergencie „záhradných“ a „poľných“ metód výroby zemiakov javia ako dosť nebezpečné. Aby sa zabránilo ich negatívnym dôsledkom tak v domácom, ako aj v komerčnom sektore, bude potrebné kontrolovať sortiment sadivových zemiakov a sortiment fungicídov ponúkaných súkromným vlastníkom v malom balení, ako aj sledovanie systémov ochrany zemiakov a používania fungicídnych prípravkov v komerčnom sektore.
V oblastiach súkromného sektora dochádza k intenzívnemu rozvoju nielen plesne neskorej, ale aj Alternaria. Väčšina majiteľov súkromných fariem neprijíma osobitné opatrenia na ochranu pred Alternaria, pričom si omylom pomýli vývoj Alternaria s prirodzeným vädnutím lístia alebo s neskorou plesňou. Vďaka masívnemu vývoju Alternaria na náchylných odrodách môžu preto pozemky slúžiť ako zdroj inokula pre komerčné výsadby.
Mechanizmy variability
Mutačný proces
Pretože výskyt mutácií je náhodný proces prebiehajúci s nízkou frekvenciou, výskyt mutácií v ktoromkoľvek mieste závisí od frekvencie mutácií tohto miesta a od veľkosti populácie. Pri štúdiu frekvencie mutácií kmeňov P. infestans sa zvyčajne určuje počet kolónií vypestovaných na selektívnych živných médiách po ošetrení chemickými alebo fyzikálnymi mutagénmi. Ako je zrejmé z údajov uvedených v tabuľke 8, frekvencia mutácií rovnakého kmeňa v rôznych lokusoch sa môže líšiť o niekoľko rádov. Vysoká frekvencia mutácií rezistencie na metalaxyl môže byť jedným z dôvodov akumulácie kmeňov rezistentných na túto látku v prírode.
Frekvencia spontánnych alebo indukovaných mutácií vypočítaná na základe laboratórnych experimentov nie vždy zodpovedá procesom prebiehajúcim v prírodných populáciách, a to z nasledujúcich dôvodov:
1. Pri asynchrónnom štiepení jadra nie je možné odhadnúť frekvenciu mutácií na jednu jadrovú generáciu. Väčšina experimentov preto poskytuje informácie iba priamo o frekvencii mutácií, pričom nerozlišuje medzi dvoma mutačnými udalosťami a jednou udalosťou nasledujúcou po mitóze.
2. Jednostupňové mutácie zvyčajne znižujú rovnováhu genómu, preto spolu so získaním novej vlastnosti klesá aj všeobecná zdatnosť organizmu. Väčšina experimentálne získaných mutácií má zníženú agresivitu a nie sú zaznamenané v prírodných populáciách. Korelačný koeficient medzi stupňom rezistencie mutantov P. infestans na fenylamidové fungicídy a rýchlosťou rastu v umelom prostredí bol teda v priemere (-0,62) a rezistenciou na fungicídy a agresivitou na listoch zemiakov (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), čo naznačuje nízku zdatnosť mutantov. Mutácie rezistencie na dimetomorf tiež sprevádzali prudké zníženie životaschopnosti (Bagirova et al., 2001).
3. Väčšina spontánnych a indukovaných mutácií je recesívnych a neprejavujú sa fenotypicky v experimentoch, ale tvoria skrytú rezervu variability v prírodných populáciách. Mutantné kmene izolované v laboratórnych experimentoch nesú dominantné alebo polodominantné mutácie (Kulish a Dyakov, 1979). Jadrová diploidia zjavne vysvetľuje neúspešné pokusy o získanie mutantov pod vplyvom UV žiarenia, ktoré sú virulentné na predtým rezistentných odrodách (McKee, 1969). Podľa výpočtov autora sa takéto mutácie môžu vyskytnúť s frekvenciou menej ako 1: 500000 XNUMX. Prechod recesívnych mutácií do homozygotného, fenotypicky exprimovaného stavu môže nastať v dôsledku sexuálnej alebo nepohlavnej rekombinácie (pozri nižšie). Avšak aj v tomto prípade môže byť mutácia maskovaná dominantnými alelami jadier divokého typu v cenotickom (viacjadrovom) mycéliu a fenotypicky fixovaná iba počas tvorby mononukleárnych zoospór.
Tabuľka 8. Frekvencia mutácií P. infestans na látky inhibujúce rast pôsobením nitrozometylmočoviny (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
zlúčenina | Frekvencia mutácií |
Oxytetracyklín | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomycín | 8,3 x10-8 |
Trichotecín | 1,8 10 x-8 |
Cykloheximid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimetomorf | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Veľkost 'populácie tiež zohráva rozhodujúcu úlohu pri výskyte spontánnych mutácií. Vo veľmi veľkých populáciách, v ktorých počet buniek N> 1 / a, kde a je rýchlosť mutácie, mutácia prestáva byť náhodným javom (Kvitko, 1974).
Výpočty ukazujú, že pri priemernom napadnutí zemiakového poľa (35 škvŕn na rastlinu) sa na jednom hektári denne vytvorí 8x1012 spór (Dyakov a Suprun, 1984). Takéto populácie zjavne obsahujú všetky mutácie povolené typom výmeny na každom mieste. Dokonca aj vzácnu mutáciu vyskytujúcu sa s frekvenciou 10 - 9 získa tisíc jedincov z miliónov žijúcich na jednom hektári zemiakového poľa. U mutácií vyskytujúcich sa s vyššou frekvenciou (napríklad 10 - 6) sa v takejto populácii môžu denne vyskytnúť rôzne párové mutácie (súčasne na dvoch lokusoch), t.j. mutačný proces nahradí rekombináciu.
Migrácie
Pre P. infestans sú známe dva hlavné typy migrácie: blízka vzdialenosť (na zemiakovom alebo susedných poliach) šírením zoosporangií vzdušnými prúdmi alebo dažďovým postrekom a na veľké vzdialenosti - výsadbou hľúz alebo transportovanými plodmi paradajok. Prvá metóda umožňuje rozšírenie zamerania choroby, druhá - vytvorenie nových ohniskov na miestach vzdialených od primárnej.
Šírenie infekcie hľuzami a plodmi rajčiakov prispieva nielen k vzniku choroby na nových miestach, ale je aj hlavným zdrojom genetickej rozmanitosti populácií. V moskovskom regióne sa pestujú zemiaky dovážané z rôznych oblastí Ruska a západnej Európy. Plody rajčiaka sa dovážajú z južných oblastí Ruska (Astrachánska oblasť, Krasnodarské územie, Severný Kaukaz). Semená paradajok, ktoré môžu slúžiť aj ako zdroje infekcie (Rubin et al., 2001), sa tiež dovážajú z južných oblastí Ruska, Číny, európskych krajín a ďalších krajín.
Podľa výpočtov E. Mayra (1974) genetické zmeny v miestnej populácii spôsobené mutáciami zriedka presahujú 10-5 na jeden lokus, zatiaľ čo v otvorených populáciách je výmena v dôsledku protiprúdu génov minimálne 10-3 - 10-4.
Migrácia v infikovaných hľuzách je zodpovedná za vstup P. infestans do Európy a šíri sa do všetkých oblastí sveta, kde sa pestujú zemiaky; spôsobili najvážnejšie populačné zmeny. Neskorá pleseň na zemiakoch sa objavila na území Ruskej ríše takmer súčasne s jej výskytom v západnej Európe.
Pretože táto choroba bola prvýkrát zaznamenaná v rokoch 1846-1847 v pobaltských štátoch a až v nasledujúcich rokoch sa rozšírila v Bielorusku a severozápadných oblastiach Ruska, je zrejmý jej západoeurópsky pôvod. Prvý zdroj neskorej plesne v Starom svete nie je taký zrejmý. Hypotéza vyvinutá Frym a spol. (Fry a spol., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin a spol., 1994) naznačuje, že parazit pochádzal najskôr z Mexika do Severnej Ameriky, kde sa rozšíril plodinami a potom bol transportovaný do západnej Európy. (obr. 7).
V dôsledku opakovaného driftu (dvojitý efekt „úzkeho miesta“) sa do Európy dostali jednotlivé klony, ktorých potomstvo spôsobilo pandémiu na celom území Starého sveta, kde sa pestujú zemiaky. Ako dôkaz tejto hypotézy autori uvádzajú po prvé všadeprítomnosť iba jedného typu párenia (A1) a po druhé homogenitu genotypov študovaných kmeňov z rôznych oblastí (všetky sú založené na molekulárnych markeroch vrátane 2 izozýmových lokusov, vzoroch DNA odtlačkov prstov a štruktúra mitochondriálnej DNA sú identické a zodpovedajú klonu US-1 opísanému v USA). Niektoré údaje však vyvolávajú pochybnosti aspoň o niektorých ustanoveniach uvedenej hypotézy. Analýza mitochondriálnej DNA P. infestans izolovanej zo vzoriek zemiakov herbára infikovaných počas prvého epifytotického obdobia 40. rokov 1. storočia ukázala, že sa líšia v štruktúre mitochondriálnej DNA od klonu US-2001, ktorý bol teda minimálne nie je jediným zdrojom infekcie v Európe (Ristaino et al, XNUMX).
Situácia s neskorou chorobou sa opäť zhoršila v 80. rokoch XNUMX. storočia. Došlo k nasledujúcim zmenám:
1) Priemerná agresivita obyvateľstva sa zvýšila, čo viedlo najmä k rozšíreniu najnebezpečnejšej formy neskorej plesne - poškodenia stopiek a stoniek.
2) V období neskorej plesne na zemiakoch došlo k posunu - od konca júla do začiatku júla, ba dokonca do konca júna.
3) Typ párenia A2, ktorý predtým v Starom svete chýbal, sa stal všadeprítomným.
Zmenám predchádzali dve udalosti: masívne použitie nového fungicídu metalaxylu (Schwinn a Staub, 1980) a vznik Mexika ako svetového vývozcu zemiakov (Niederhauser, 1993). V súlade s tým boli predložené dva dôvody populačných zmien - konverzia páriaceho sa typu pod vplyvom metalaxylu (Ko, 1994) a masívne zavedenie nových kmeňov infikovaných hľúz z Mexika (Fry a Goodwin, 1995). Aj keď interkonverzie druhov párenia pod vplyvom metalaxylu nezískal iba Ko, ale aj práce uskutočnené v laboratóriu Moskovskej štátnej univerzity (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), je vhodnejšia druhá hypotéza. Spolu s výskytom druhého typu párenia došlo k vážnym zmenám v genotypoch kmeňov ruského P. infestans, vrátane neutrálnych génov (izozým a lokusy RFLP), ako aj v štruktúre mitochondriálnej DNA. Komplex týchto zmien nemožno vysvetliť pôsobením metalaxylu; došlo skôr k masívnemu importu nových kmeňov z Mexika, ktoré, keďže bolo agresívnejšie (Kato et al., 1997), vytlačilo staré kmene (US-1) a stalo sa dominantným v populáciách. Zmena zloženia európskych populácií prebehla vo veľmi krátkom čase - od roku 1980 do roku 1985 (Fry a kol., 1992). Na území bývalého ZSSR sa „nové kmene“ našli v zbierkach z Estónska v roku 1985, teda skôr ako v Poľsku a Nemecku (Goodwin et al., 1994). Naposledy bol „starý kmeň US-1“ v Rusku izolovaný z infikovaného rajčiaka v moskovskej oblasti v roku 1993 (Dolgova et al., 1997). Aj vo Francúzsku sa „staré“ kmene našli vo výsadbe paradajok až do začiatku 90. rokov, teda po tom, čo na zemiakoch zmizli už dávno (Leberton a Andrivon, 1998). Zmeny v kmeňoch P. infestans ovplyvnili mnoho znakov, vrátane tých, ktoré majú veľký praktický význam, a zvýšili škodlivosť neskorej plesne.
Sexuálna rekombinácia
Aby sexuálna rekombinácia prispievala k variabilite, je potrebné po prvé prítomnosť dvoch typov párenia v populácii v pomere blízkom 1: 1 a po druhé prítomnosť počiatočnej variability populácie.
Pomer typov párenia sa veľmi líši v rôznych populáciách a dokonca aj v rôznych rokoch v jednej populácii (tabuľka 9,10, 90). Dôvody takýchto drastických zmien vo frekvenciách druhov párenia v populáciách (ako napríklad v Rusku alebo v Izraeli na začiatku 2002. rokov minulého storočia) nie sú známe, predpokladá sa však, že je to spôsobené zavedením konkurencieschopnejších klonov (Cohen, XNUMX).
Niektoré nepriame údaje naznačujú priebeh sexuálneho procesu v určitých rokoch a v určitých regiónoch:
1) Štúdie populácií z moskovského regiónu preukázali, že u 13 populácií, v ktorých bol podiel druhu párenia A2 nižší ako 10%, bola celková genetická diverzita vypočítaná pre tri izozýmové lokusy 0,08 a u 14 populácií, v ktorých podiel A2 prekročil 30%, genetická diverzita bola dvakrát vyššia (0,15) (Elansky et al., 1999). Čím vyššia je pravdepodobnosť pohlavného styku, tým väčšia je genetická rozmanitosť populácie.
2) Vzťah medzi pomerom druhov párenia v populáciách a intenzitou tvorby oospór bol pozorovaný v Izraeli (Cohen et al., 1997) a v Holandsku
(Flier a kol., 2004). Naše štúdie ukázali, že v populáciách, v ktorých izoláty s páriacim sa typom A2 predstavovali 62, 17, 9 a 6%, sa oospóry našli v 78, 50, 30 a 15% analyzovaných zemiakových listov (s 2 alebo viac škvrnami).
U vzoriek s 2 alebo viac škvrnami bola oveľa väčšia pravdepodobnosť, že obsahujú oospóry ako u vzoriek s 1 škvrnou (32, respektíve 14% vzoriek) (Apryshko et al., 2004).
Oospory sa oveľa častejšie vyskytovali v listoch strednej a dolnej vrstvy rastliny zemiakov (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) V niektorých regiónoch boli objavené jedinečné genotypy, ktorých výskyt je spojený so sexuálnou rekombináciou. V Poľsku v roku 1989 a vo Francúzsku v roku 1990 boli teda kmene homozygotné pre
fosfát izomeráza (GPI 90/90). Pretože predtým sa 10 rokov stretlo iba s 90/100 heterozygotmi, pripisuje sa homozygotnosť sexuálnej rekombinácii (Sujkowski et al., 1994). V Kolumbii (USA) sú izoláty kombinujúce A2 s GPI 100/110 a A1 s GPI 100/100 bežné, avšak na konci sezóny 1994 (16. augusta a 9. septembra) kmene s rekombinantnými genotypmi (A1 GPI 100/110 a A2 GPI 100/100) (Miller a kol., 1997).
4) V niektorých populáciách z Poľska (Sujkowski et al., 1994) a zo Severného Kaukazu (Amatkhanova et al., 2004) distribúcia lokusov DNA odtlačkov prstov a lokusov alozymového proteínu zodpovedá Hardy-Weinbergovej distribúcii, čo naznačuje
o vysokom podiele príspevku sexuálnej rekombinácie k variabilite populácií. V iných regiónoch Ruska sa nezistila žiadna korešpondencia s Hardy-Weinbergovou distribúciou v populáciách, ale ukázala sa prítomnosť väzbovej nerovnováhy, čo naznačuje prevahu klonálnej reprodukcie (Elansky et al., 1999).
5) Genetická diverzita (GST) medzi kmeňmi s rôznymi typmi párenia (A1 a A2) bola nižšia ako medzi rôznymi populáciami (Sujkowski et al., 1994), čo nepriamo naznačuje sexuálne kríženie.
Príspevok sexuálnej rekombinácie k populačnej rozmanitosti zároveň nemôže byť veľmi vysoký. Tento príspevok bol vypočítaný pre populácie moskovského regiónu (Elansky et al., 1999). Podľa výpočtov Lewontina (1979) „rekombinácia, ktorá môže produkovať nové varianty z dvoch lokusov s frekvenciou nepresahujúcou súčin ich heterozygotnosti, bude účinná, iba ak sú hodnoty heterozygotnosti pre obidve alely už vysoké“.
S pomerom dvoch typov párovania, ktorý je typický pre moskovský región, rovným 4: 1, bude frekvencia rekombinácie 0,25. Pravdepodobnosť, že skrížené kmene budú heterozygotné pre dva z troch študovaných izozygotných lokusov v študovaných populáciách, bola 0,01 (2 kmene zo 177). Následkom toho by pravdepodobnosť výskytu dvojitých heterozygotov v dôsledku rekombinácie nemala prekročiť ich súčin vynásobený pravdepodobnosťou kríženia (0,25x0,02x0,02) = 10-4, t.j. sexuálne rekombinanty zvyčajne nespadajú do študovanej vzorky kmeňov. Tieto výpočty sa uskutočnili pre populácie z moskovského regiónu, ktoré sa vyznačujú pomerne vysokou variabilitou. V monomorfných populáciách, ako sú tie sibírske, nemôže sexuálny proces, aj keď sa vyskytuje v jednotlivých populáciách, ovplyvniť ich genetickú rozmanitosť.
Okrem toho je P. infestans charakterizovaný častým nesprávnym zarovnaním chromozómov v meióze, ktoré vedie k aneuploidii (Carter et al., 1999). Takéto porušenia znižujú plodnosť hybridov.
Parasexuálna rekombinácia, konverzia mitotického génu
V experimentoch na spájaní kmeňov P. infestans s mutáciami rezistencie na rôzne inhibítory rastu sa zistil výskyt misolátov rezistentných na oba inhibítory (Shattock a Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Kmene rezistentné na dva inhibítory rastu vznikli v dôsledku heterokaryotizácie mycélia a v tomto prípade sa štiepili počas reprodukcie mononukleárnymi zoosporami (Judelson, Ge Yang, 1998), alebo sa neštiepili u monozoporóznych potomkov, pretože mali tetraploidné (keďže pôvodné izoláty sú diploidné) jadrá (K 1979). Heterozygotné diploidy sa segregovali na veľmi nízkej frekvencii v dôsledku haploidizácie, nedisjunkcie chromozómov a mitotického prechodu (Poedinok et al., 1982). Frekvencia týchto procesov sa mohla zvýšiť pomocou určitých účinkov na heterozygotné diploidy (napríklad UV ožarovanie klíčiacich spór).
Aj keď k formovaniu vegetatívnych hybridov s dvojitou rezistenciou nedochádza iba in vitro, ale aj u zemiakových hľúz infikovaných zmesou mutantov (Kulish et al., 1978), je dosť ťažké posúdiť úlohu parasexuálnej rekombinácie pri generovaní nových genotypov v populáciách. Frekvencia tvorby segregantov v dôsledku haploidizácie, nedisjunkcie chromozómov a mitotického kríženia bez zvláštnych účinkov je zanedbateľná (menej ako 10-3).
Vznik homozygotných segregantov heterozygotných kmeňov môže byť založený na mitotickom krížení a mitotickej génovej konverzii, ktorá sa u P. sojae vyskytuje s frekvenciou 3 x 10-2 až 5 x 10-5 na jeden lokus, v závislosti od kmeňa (Chamnanpunt et al. , 2001).
Aj keď sa ukázalo, že frekvencia výskytu heterokaryónov a heterozygotných diploidov je neočakávane vysoká (dosahujúca desiatky percent), tento proces nastáva iba vtedy, keď sa spoja mutantné kultúry získané z rovnakého kmeňa. Pri použití rôznych kmeňov izolovaných z prírody k heterokaryotizácii nedochádza (alebo sa vyskytuje s veľmi nízkou frekvenciou) v dôsledku prítomnosti vegetatívnej nekompatibility (Poedinok a Dyakov, 1981; Anikina a kol., 1997b; Cherepennikova-Anikina a kol., 2002). Následkom toho možno úlohu parasexuálnej rekombinácie znížiť iba na intraklonálnu rekombináciu v heterozygotných jadrách a prechod jednotlivých génov do homozygotného stavu bez sexuálneho procesu. Tento proces môže mať epidemiologický význam u kmeňov s recesívnymi alebo semi-dominantnými mutáciami rezistencie na fungicídy. Jeho prechod do homozygotného stavu v dôsledku parasexuálneho procesu zvýši odolnosť nosiča mutácie (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresia génov
Heterotalické druhy Phytophthora sú schopné kríženia s tvorbou hybridných oospór (pozri Vorob'eva a Gridnev, 1983; Sansome a kol., 1991; Veld a kol., 1998). Prirodzený hybrid dvoch druhov Phytophthora bol taký agresívny, že zabil tisíce jelší vo Veľkej Británii (Brasier et al., 1999). P. infestans sa môže vyskytnúť u iných druhov rodu (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum atď.) Na bežných hostiteľských rastlinách a v pôde, ale v literatúre je málo informácií o možnostiach medzidruhových hybridov. Za laboratórnych podmienok boli hybridy získané medzi P. infestans a P. Mirabilis (Goodwin a Fry, 1994).
Tabuľka 9. Podiel kmeňov P. infestans s párením typu A2 v rôznych krajinách sveta v období rokov 1990 až 2000 (podľa údajov z otvorených literárnych zdrojov a stránok www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Krajiny | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bielorusko | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgicko | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekvádor | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estónsko | 8 (12) | ||||||||||
Anglicko | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Fínsko | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francúzsko | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Maďarsko | 72 (32) | ||||||||||
Írsko | 4 (145) | ||||||||||
Sever. Írsko | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Holandsko | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Nórsko | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Poľsko | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Škótsko | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Švédsko | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Kórea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Čína | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguaj | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexiko (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabuľka 10. Podiel kmeňov P. infestans s páriacim sa typom A2 v rôznych krajinách sveta v období rokov 2000 až 2011.
Krajiny | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Rakúsko | 65 (83) | ||||||||||
Bielorusko | 42 (78) | ||||||||||
Belgicko | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Švajčiarsko | 89 (19) | ||||||||||
Česká republika | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Nemecko | 95 (53) | ||||||||||
Dánsko | 48 (52) | ||||||||||
Ekvádor | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estónsko | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Anglicko | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Fínsko | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francúzsko | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Maďarsko | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Sever. Írsko | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Holandsko | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Nórsko | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Poľsko | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Škótsko | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Švédsko | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovensko | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Kórea | 46 (26) | ||||||||||
Brazília | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Čína | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamika genotypového zloženia populácií
K zmenám v genotypovom zložení populácií P. infestans môže dôjsť pod vplyvom migrácie nových klonov z iných regiónov, poľnohospodárskych postupov (zmena odrôd, použitie fungicídov) a poveternostných podmienok. Vonkajšie vplyvy ovplyvňujú rôzne klony v rôznych fázach životného cyklu; preto populácie každoročne zažívajú cyklické zmeny vo frekvenciách génov podliehajúcich selekcii v dôsledku zmeny prevažujúcej úlohy driftu a selekcie génov.
Vplyv odrody
Nové odrody s účinnými génmi pre vertikálnu rezistenciu (R-gény) sú silným selektívnym faktorom pri selekcii klonov s komplementárnymi génmi virulencie v populáciách P. infestans. Pri absencii nešpecifickej rezistencie odrody zemiakov, ktorá inhibuje rast populácie patogénov, nastáva proces zmeny dominantných klonov v populácii veľmi rýchlo. Po rozšírení odrody Domodedovskij, ktorá má gén rezistencie na R3, sa v moskovskom regióne zvýšila frekvencia klonov virulentných pre túto odrodu z 0,2 na 0,82 za jeden rok (Dyakov a Derevjagina, 2000).
Zmena v frekvenciách génov virulencie (patotypov) v populáciách však nastáva nielen pod vplyvom kultivovaných odrôd zemiakov. Napríklad v Bielorusku do roku 1977 dominovali klony s génmi virulencie 1 a 4, čo bolo spôsobené kultiváciou odrôd zemiakov s génmi rezistencie R1 a R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Na konci 70. rokov 2002. storočia sa však objavili klony s rôznymi génmi virulencie a ich kombináciami a gény komplementárnej rezistencie sa nikdy nepoužívali pri šľachtení zemiakov (gény extra virulencie) (Ivanyuk et al., XNUMX). Dôvodom pre objavenie sa týchto klonov je zjavne migrácia húb zemiakov do Európy z Mexika. Doma sa tieto klony vyvíjali nielen na kultivovaných zemiakoch, ale aj na divých druhoch, ktoré niesli rôzne gény rezistencie; na prežitie v týchto podmienkach bola preto nevyhnutná kombinácia mnohých génov virulencie v genóme.
Pokiaľ ide o odrody s nešpecifickou rezistenciou, tie znižovaním rýchlosti reprodukcie patogénu brzdia vývoj jeho populácií, čo, ako už bolo spomenuté, je funkciou čísla. Pretože agresivita je polygénna, klony obsahujúce väčšie množstvo génov pre „agresivitu“ sa hromadia čím skôr, tým vyššia je veľkosť populácie. Preto vysoko agresívne rasy nie sú produktom adaptácie na kultivované odrody s nešpecifickou rezistenciou, ale naopak, je pravdepodobnejšie ich zistenie vo výsadbách vysoko náchylných odrôd, ktoré sú akumulátormi spór parazitov.
V Rusku sa teda najagresívnejšie populácie P. Infestans nachádzali v zónach každoročných epifytotík (populácie zo Sachalinskej, Leningradskej a Brjanskej oblasti). Ukázalo sa, že agresivita týchto populácií bola vyššia ako u mexickej populácie (Filippov et al., 2004).
Okrem toho sa v listoch rezistentných odrôd vytvára menej oospór ako u náchylných odrôd (Hanson a Shattock, 1998), to znamená, že nešpecifická odolnosť odrody tiež znižuje rekombinačné schopnosti parazita a možnosť alternatívnych metód zimovania.
Vplyv fungicídov
Fungicídy nielen znižujú počet fytopatogénnych húb, t.j. ovplyvňujú kvantitatívne charakteristiky ich populácií, ale môžu tiež meniť frekvencie jednotlivých genotypov, t.j. ovplyvňujú kvalitatívne zloženie populácie. Medzi najdôležitejšie ukazovatele populácií meniacich sa pod vplyvom fungicídov patria: zmeny odolnosti voči fungicídom, zmeny agresivity a virulencie a zmeny reprodukčných systémov.
Vplyv fungicídov na odolnosť a agresivitu populácií
Stupeň tohto vplyvu je v prvom rade určený typom použitého fungicídu, ktorý je možné podmienečne rozdeliť na polysite, oligozit a monozit.
Prvý obsahuje väčšinu kontaktných fungicídov. Odpor voči nim (ak je to vôbec možné) je riadený veľkým počtom veľmi slabo expresívnych génov. Tieto vlastnosti určujú neprítomnosť viditeľných zmien v odolnosti populácie po ošetrení fungicídmi (aj keď v niektorých experimentoch sa dosiahlo určité zvýšenie odolnosti). Populácia húb konzervovaná po postreku kontaktnými fungicídmi pozostáva z dvoch skupín kmeňov:
1) Kmene konzervované v oblastiach rastlín neošetrených týmto liekom. Pretože nedošlo k žiadnemu kontaktu s fungicídom, agresivita a odolnosť týchto kmeňov sa nemení.
2) Kmene v kontakte s fungicídom, ktorých koncentrácia v kontaktných bodoch bola nižšia ako smrteľná. Ako už bolo uvedené vyššie, rezistencia tejto časti populácie sa tiež nemení, avšak kvôli čiastočnému škodlivému účinku fungicídu už pri subletálnej koncentrácii na metabolizmus bunky huby klesá všeobecná zdatnosť a jej parazitická zložka, agresivita (Derevyagina a Dyakov, 1990).
Teda aj časť populácie, ktorá nezomrela, vystavená kontaktu s fungicídom, má slabú agresivitu a nemôže byť zdrojom epifytotík. Podmienkou úspechu ochranných opatrení je preto starostlivé ošetrenie, ktoré znižuje frekvenciu podielu populácie, ktorá nie je v kontakte s fungicídom. Odolnosť voči oligositovým fungicídom je riadená niekoľkými aditívnymi génmi.
Mutácia každého génu vedie k určitému zvýšeniu rezistencie a celkový stupeň rezistencie je spôsobený pridaním takýchto mutácií. Preto k zvyšovaniu odporu dochádza v krokoch. Príkladom postupného zvyšovania rezistencie sú mutácie rezistencie na fungicíd dimetomorf, ktorý sa široko používa na ochranu zemiakov pred neskorou plesňou. Rezistencia na dimetomorf je polygénna a aditívna. Jednostupňová mutácia mierne zvyšuje odolnosť.
Každá nasledujúca mutácia zmenšuje cieľovú veľkosť a následne frekvenciu nasledujúcich mutácií (Bagirova et al., 2001). K nárastu priemernej rezistencie populácie po viacnásobnom ošetrení oligositovým fungicídom dochádza postupne a postupne. Rýchlosť tohto procesu je určená najmenej tromi faktormi: frekvenciou mutácií génov rezistencie, koeficientom rezistencie (pomer letálnej dávky rezistentného kmeňa k citlivému) a účinkom mutácií génov rezistencie na kondíciu.
Frekvencia výskytu každej nasledujúcej mutácie je nižšia ako predchádzajúca, preto má proces tlmiaci charakter (Bagirova et al., 2001). Ak však v populácii dôjde k rekombinačným procesom (sexuálnym alebo parasexuálnym), je možné kombinovať rôzne mutácie rodičov v hybridnom kmeni a proces urýchliť. Populácie panmixu preto získavajú rezistenciu rýchlejšie ako populácie agamu a v druhom prípade populácie, ktoré nemajú bariéry vegetatívnej nekompatibility rýchlejšie ako populácie oddelené týmito bariérami. V tomto ohľade prítomnosť kmeňov v populáciách, ktoré sa líšia typmi párenia, urýchľuje proces získania rezistencie na oligozitické fungicídy.
Druhý a tretí faktor neprispievajú k rýchlej akumulácii kmeňov rezistentných na dimetomorf v populáciách. Každá nasledujúca mutácia približne zdvojnásobuje rezistenciu, ktorá je nevýznamná, a súčasne znižuje rýchlosť rastu v umelom prostredí aj agresivitu (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Možno to je dôvod, prečo medzi prírodnými kmeňmi P. infestans neexistujú prakticky žiadne rezistentné kmene, ani tie, ktoré sa zbierajú zo sadov zemiakov ošetrených dimetomorfom.
Populácia ošetrená oligositovým fungicídom bude tiež pozostávať z dvoch skupín kmeňov: tých, ktoré neboli v kontakte s fungicídom, a preto nezmenili pôvodné vlastnosti (ak sa v tejto skupine nájdu rezistentné kmene, nebudú sa hromadiť kvôli vyššej agresivite a konkurencieschopnosti citlivých kmeňov), a kmene v kontakte s subletálnymi koncentráciami fungicídu. Medzi nimi je možná akumulácia rezistentných kmeňov, pretože tu majú výhody oproti citlivým.
Preto pri použití oligositových fungicídov nejde ani tak o dôkladné ošetrenie, ako o vysokú koncentráciu liečiva, niekoľkonásobne vyššiu ako je letálna dávka, pretože pri postupnej mutagenéze je počiatočná rezistencia mutovaných kmeňov nízka.
Nakoniec sú mutácie rezistencie na monozitické fungicídy vysoko expresívne, to znamená, že jedna mutácia môže vykazovať vysokú úroveň rezistencie až po úplnú stratu citlivosti. Preto k zvýšeniu odolnosti populácií dochádza veľmi rýchlo.
Príkladom takýchto fungicídov sú fenylamidy vrátane najbežnejšieho fungicídu, metalaxylu. Mutácie rezistencie na ňu vznikajú s vysokou frekvenciou a stupeň rezistencie u mutantov je veľmi vysoký - presahuje citlivý kmeň tisíckrát a viac (Derevyagina et al., 1993). Aj keď rýchlosť rastu a agresivita rezistentných mutantov klesá na pozadí smrti citlivých kmeňov zo systémového fungicídu, počet rezistentných populácií rýchlo rastie a paralelne s tým rastie aj ich agresivita. Preto sa po niekoľkých rokoch používania fungicídu môže agresivita rezistentných kmeňov nielen vyrovnať agresivite citlivých, ale ju aj prekonať (Derevyagina a Dyakov, 1992).
Účinok na sexuálnu rekombináciu
Pretože častý výskyt spojovacieho typu A2 v populáciách P. infestans sa zhodoval s intenzívnym používaním metalaxylu proti neskorej plesni, bolo navrhnuté, že metalaxyl indukuje premenu spojovacieho typu. U P. parasitica bola experimentálne dokázaná takáto premena pôsobením chlóronebu a metalaxylu (Ko, 1994). Jediný prechod na médiu s nízkou koncentráciou metalaxylu viedol k vzniku homotalických izolátov z kmeňa P. infestans citlivého na metalaxylu s páriacim sa typom A1 (Savenkova a Cherepnikova-Anikina, 2002). Počas nasledujúcich pasáží na médiu s vyššou koncentráciou metalaxylu sa nezistil ani jeden izolát párovacieho typu A2, avšak väčšina izolátov po krížení s izolátmi A2 namiesto oporóp vytvorila škaredé akumulácie mycélia a boli sterilné. Pasáže rezistentného kmeňa majúceho párovací typ A2 na médiu s vysokou koncentráciou metalaxylu nám umožnili detekovať tri formy zmien párovacieho typu: 1) úplná sterilita po krížení s izolátmi A1 a A2; 2) homotalizmus (tvorba oospór v monokultúre); 3) prevod typu párenia A2 na A1. Metalaxyl môže teda spôsobiť zmeny v typoch párenia v populáciách P. infestans a následne v nich výskyt sexuálnej rekombinácie.
Účinky na vegetatívnu rekombináciu
Niektoré gény pre rezistenciu na antibiotiká zvyšovali frekvenciu hyfálnej heterokaryotizácie a nukleárnej diploidizácie (Poedinok a Dyakov, 1981). Ako už bolo uvedené skôr, k heterokaryotizácii hýf počas fúzie rôznych kmeňov P. infestans dochádza veľmi zriedkavo kvôli fenoménu vegetatívnej nekompatibility u tejto huby. Gény rezistencie na niektoré antibiotiká však môžu mať vedľajšie účinky vyjadrené prekonaním vegetatívnej nekompatibility. Túto vlastnosť vlastnil gén rezistencie na mutantný streptomycín 1S-1. Prítomnosť takýchto mutantov v poľných populáciách phytophthory môže zvýšiť tok génov medzi kmeňmi a urýchliť adaptáciu celej populácie na nové odrody alebo fungicídy.
Určité fungicídy a antibiotiká môžu ovplyvniť frekvenciu mitotickej rekombinácie, čo môže tiež zmeniť frekvencie genotypov v populáciách. Široko používaný fungicíd benomyl sa viaže na beta-tubulín, proteín, z ktorého sa vytvárajú mikrotubuly cytoskeletu, a tým narúša procesy separácie chromozómov v anafáze mitózy, čím zvyšuje frekvenciu mitotickej rekombinácie (Hastie, 1970).
Rovnakú vlastnosť má fungicíd para-fluórfenylalanín, ktorý sa používa na liečbu holandských chorôb v brestoch. Para-fluórfenylalanín zvyšoval frekvenciu rekombinácie u heterozygotných diploidov P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cyklické zmeny v genotypovom zložení populácií v životnom cykle P. infestans
Klasický vývojový cyklus P. infestans v miernom pásme pozostáva zo 4 fáz.
1) Fáza exponenciálneho rastu populácie (polycyklická fáza) s krátkymi generáciami. Táto fáza sa zvyčajne začína v júli a trvá 1,5 - 2 mesiace.
2) Fáza zastavenia rastu populácie v dôsledku prudkého poklesu podielu nepostihnutého tkaniva alebo nástupu nepriaznivých poveternostných podmienok. Táto fáza v poľnohospodárskych podnikoch, ktoré vykonávajú predčasné pred zberom listov, vypadáva z ročného cyklu.
3) Fáza zimovania na hľuzách sprevádzaná výrazným poklesom populácie v dôsledku náhodnej infekcie hľúz, pomalým vývojom infekcie v nich, absenciou opätovnej infekcie hľúz, hnilobou a utratením postihnutých hľúz za normálnych skladovacích podmienok.
4) Fáza pomalého vývoja v pôde a na semenákoch (monocyklická fáza), v ktorej môže generácia trvať mesiac alebo viac (koniec mája - začiatok júla). Zvyčajne v tejto dobe je choré listy ťažké odhaliť, dokonca aj pri zvláštnych pozorovaniach.
Fáza exponenciálneho rastu populácie (polycyklická fáza)
Početné pozorovania (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) ukázali, že na začiatku epifytoty prevažujú nízko virulentné a mierne agresívne klony, ktoré sú následne nahradené virulentnejšími a agresívnejšími. miera rastu agresivity populácie je tým vyššia, čím menej odolná je odroda hostiteľskej rastliny.
Ako populácia rastie, zvyšuje sa koncentrácia selektívne dôležitých génov zavedených do komerčných odrôd (R1-R4) aj selektívne neutrálnych (R5-R11). Takže v populáciách blízko Moskvy v roku 1993 sa priemerná virulencia od konca júla do polovice augusta zvýšila z 8,2 na 9,4 a najväčší nárast sa pozoroval u selektívne neutrálneho génu virulencie R5 (z 31 na 86% virulentných klonov) (Smirnov, 1996 ).
Pokles rýchlosti rastu populácie je sprevádzaný poklesom parazitnej aktivity populácie. Preto je v depresívnych rokoch celkový počet rás aj podiel vysoko virulentných rás nižší ako u epifytotických (Borisenok, 1969). Ak sa na vrchole epifytotických poveternostných podmienok zmení na nepriaznivé podmienky pre neskorú pleseň a napadnutie zemiakmi poklesne, zníži sa aj koncentrácia vysoko virulentných a agresívnych klonov (Rybakova et al., 1987).
Nárast frekvencií génov ovplyvňujúcich virulenciu a agresivitu populácie môže byť spôsobený selekciou virulentnejších a agresívnejších klonov v zmiešanej populácii. Na demonštráciu selekcie bola vyvinutá metóda analýzy neutrálnych mutácií, ktorá sa úspešne použila v populáciách kvasiniek chemostatu (Adams et al., 1985) a Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Frekvencia mutantov rezistentných na blasticidín S v poľnej populácii P. infestans klesala paralelne s rastom agresivity populácie, čo naznačuje zmenu dominantných klonov v procese rastu populácie (Rybakova et al., 1987).
Fáza zimovania na hľuzách
Počas zimovania v zemiakových hľuzách virulencia a agresivita kmeňov P. infestans klesá a pokles virulencie nastáva pomalšie ako agresivita (Rybakova a Dyakov, 1990). Zdá sa, že za podmienok vedúcich k rýchlemu rastu veľkosti populácie (r-selekcia) sú užitočné „extra“ gény virulencie a vysoká agresivita, preto je vývoj epifytotík sprevádzaný výberom tých naj virulentnejších a najagresívnejších klonov. V podmienkach nasýtenia prostredia, keď nezohráva dôležitú úlohu miera reprodukcie, ale perzistencia existencie v nepriaznivých podmienkach (K-výber), „extra“ gény virulencie a agresivity znižujú kondíciu a klony s týmito génmi vymrú ako prvé, takže priemerná agresivita a virulencia obyvateľstva klesá.
Vegetačná fáza v pôde
Táto fáza je najzáhadnejšia v životnom cykle (Andrivon, 1995). Jeho existencia sa predpokladá čisto špekulatívne - kvôli nedostatku informácií o tom, čo sa stane s patogénom počas dlhého obdobia (niekedy viac ako mesiac) - od výskytu sadeníc zemiakov po výskyt prvých škvŕn choroby na nich. Na základe pozorovaní a experimentov sa zrekonštruovalo správanie huby v tomto období života (Hirst a Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulácia huby sa môže vytvoriť na infikovaných hľuzách v pôde. Výsledné spóry klíčia s hýfami, ktoré môžu v pôde dlho vegetovať. Primárne (vytvorené na hľuzách) a sekundárne (na mycéliu v pôde) spóry stúpajú na povrch pôdy kapilárnymi prúdmi, ale schopnosť infikovať zemiaky získavajú až potom, čo jej spodné listy zostúpia a dostanú sa do kontaktu s povrchom pôdy. Takéto listy (menovite sa na nich nachádzajú prvé škvrny choroby) sa netvoria okamžite, ale po dlhšom raste a vývoji vrcholov zemiakov.
V životnom cykle P. infestans teda môže existovať aj saprotrofná vegetačná fáza. Ak je v parazitickej fáze životného cyklu najdôležitejšou zložkou kondície agresivita, potom je v saprotrofickej fáze výber zameraný na zníženie parazitických vlastností, ako je to experimentálne preukázané pre niektoré fytopatogénne huby (pozri Carson, 1993). V tejto fáze cyklu by sa preto agresívne vlastnosti mali strácať najintenzívnejšie. Zatiaľ sa však neuskutočnili žiadne priame experimenty, ktoré by potvrdili vyššie uvedené predpoklady.
Sezónne zmeny ovplyvňujú nielen patogénne vlastnosti P. infestans, ale aj odolnosť voči fungicídom, ktoré rastú v polycyklickej fáze (počas epifytotík), a znižujú sa počas zimného skladovania (Derevyagina et al., 1991; Kadish a Cohen, 1992). Obzvlášť intenzívny pokles odolnosti voči metalaxylu bol pozorovaný v období medzi výsadbou postihnutých hľúz a objavením sa prvých škvŕn choroby v teréne.
Vnútrošpecifická špecializácia a jej vývoj
P. infestans spôsobuje epidémie u dvoch komerčne dôležitých plodín, zemiakov a paradajok. Epifytózy na zemiakoch sa začali čoskoro potom, ako sa huba dostala do nových oblastí. Porážka rajčiaka sa zaznamenala aj krátko po objavení sa infekcie na zemiakoch, ale epifytózy na rajčiakoch sa zaznamenali až o sto rokov neskôr - v polovici XNUMX. storočia. Tu píše Hallegli a Niederhauser o porážke paradajok v USA
(1962): „Asi 100 rokov po ťažkej epifytotypii z roku 1845 sa uskutočnilo len málo alebo takmer žiadne pokusy o získanie rezistentných odrôd rajčiaka. Aj keď bola neskorá pleseň na rajčiakoch prvýkrát zaznamenaná už v roku 1848, až do silného prepuknutia choroby v roku 1946 sa stala predmetom vážnej pozornosti chovateľov tejto rastliny. Na území Ruska bola v 60. storočí zaregistrovaná neskorá pleseň paradajková. „Vedci dlho nevenovali pozornosť tejto chorobe, pretože nespôsobovala významné ekonomické škody. Ale v 70. a 1979. rokoch. Epifytózy XX. Storočia z neskorej plesne na rajčiakoch sa pozorujú aj v Sovietskom zväze, hlavne v oblasti dolnej Volhy, na Ukrajine, na Zakaukazsku, v Moldavsku ... “(Balashova, XNUMX).
Od tej doby je pleseň rajčiaková neskorou plesňou každoročná, ktorá sa šíri po celom území priemyselného a domáceho pestovania a spôsobuje tejto plodine obrovské ekonomické škody. Čo sa stalo? Prečo sa prvý výskyt parazita na zemiakoch a epifytotická lézia tejto plodiny vyskytli takmer súčasne a prečo trvalo storočie, kým sa epifytotikum objavilo na paradajke? Tieto rozdiely podporujú skôr mexický ako juhoamerický zdroj infekcie. Ak sa druh Phytophthora infestans vyvinul ako parazit u mexických druhov hľúz rod rodu Solanum, potom je pochopiteľné, prečo boli tak silno ovplyvnené kultivované zemiaky patriace do rovnakej časti rodu ako mexický druh, ale z dôvodu absencie koevolúcie s parazitom, u ktorého sa nevyvinuli mechanizmy špecifickej a nešpecifickej rezistencie.
Paradajka patrí do inej časti rodu, druh jej výmeny má výrazné rozdiely od hľuzovitých druhov, preto napriek skutočnosti, že paradajka nie je mimo potravinovej špecializácie P. infestans, bola intenzita jej porážky pre vážne ekonomické straty nedostatočná.
Vznik epifytotík na rajčiaku je spôsobený vážnymi genetickými zmenami u parazita, ktoré pri parazitovaní zvýšili jeho adaptabilitu (patogenitu). Veríme, že novou formou špecializovanou na parazitovanie na rajčiakoch je rasa T1, ktorú opísal M. Gallegly, ovplyvňujúca odrody cherry paradajok (Red Cherry, Ottawa), odolné voči rase T0 rozšírenej na zemiakoch (Gallegly, 1952). Podľa všetkého mutácia (alebo séria mutácií), ktorá zmenila rasu T0 na rasu T1 a viedla k objaveniu klonov vysoko prispôsobených porážke rajčiaka. Ako sa často stáva, zvýšenie patogenity u jedného hostiteľa bolo sprevádzané poklesom u iného hostiteľa, to znamená, že vznikla počiatočná, ešte nie úplná vnútrodruhová špecializácia - na zemiaky (rasa T0) a paradajky (rasa T1).
Aký je dôkaz tohto predpokladu?
- Výskyt na zemiakoch a paradajkách. Na listoch paradajok prevažuje rasa T1, zatiaľ čo na listoch zemiakových je to ojedinelé. Podľa S.F.Bagirovej a T.A. Oreshonkova (nepublikovaná) v moskovskom regióne v rokoch 1991-1992 bol výskyt rasy T1 vo výsadbe zemiakov 0% a vo výsadbe paradajok - 100%; v rokoch 1993-1995 - 33%, respektíve 90%; v roku 2001 - 0% a 67%. Podobné údaje boli získané v Izraeli (Cohen, 2002). Pokusy s infekciou zemiakových hľúz izolátmi rasy T1 a zmesou izolátov T0 a T1 ukázali, že izoláty rasy T1 sú v hľuzách slabo konzervované a sú nahradené izolátmi rasy T0 (Dyakov a kol., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamika závodu T1 pri výsadbe paradajok. Primárna infekcia listov rajčiaka sa uskutočňuje izolátmi rasy T0, ktoré dominujú pri analýze infekcie v prvých škvrnách vytvorených na listoch. To potvrdzuje všeobecne akceptovanú schému migrácie parazitov: Hlavnú infekciu zo zemiakov tvorí rasa T0, avšak malý počet klonov T1 konzervovaných v zemiakoch, raz na rajčiakoch, vytláča rasu T0 a hromadí sa na konci epifytotického obdobia. Je tiež možné, že existuje alternatívny zdroj infekcie listov rajčiaka rasou T1, ktorý nie je taký silný ako zemiakové hľuzy a listy, ale je konštantný. Preto tento zdroj má slabý vplyv na genetickú štruktúru populácie infikujúcej paradajky, ale následne určuje akumuláciu rasy T1 (Rybakova, 1988; Dyakov a kol., 1994).
3) Agresivita na zemiaky a paradajky. Umelá infekcia paradajok a listov zemiakov izolátmi rás T0 a T1 ukázala, že prvé sú agresívnejšie pre zemiaky ako pre paradajky a druhé sú agresívnejšie pre paradajky ako pre zemiaky. Tieto rozdiely sa prejavujú pri vytesňovaní izolátov nie „vlastnej“ rasy zo zmiešanej populácie počas pasáže na listoch v skleníku (Dyakov a kol., 1975) a na poľných pozemkoch (Leberton a kol., 1999); rozdiely v minimálnej infekčnej záťaži, dobe latencie, veľkosti infekčných škvŕn a produkcii spór (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez a kol., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna a kol., 2004).
Agresivita izolátov rasy T1 na kultivary rajčiakov, ktorým chýbajú gény rezistencie, je taká vysoká, že tieto izoláty spórujú na listoch ako na živnom médiu bez nekrotizácie infikovaného tkaniva (Dyakov a kol., 1975; Vega-Sanchez a kol., 2000).
4) Virulencia pre zemiaky a paradajky. Rasa T1 ovplyvňuje odrody čerešňových paradajok s génom rezistencie Ph1, zatiaľ čo rasa T0 nie je schopná infikovať tieto odrody, t.j. má užšiu virulenciu. Vo vzťahu k diferenciátorom
R-gény zemiakov sú nepriamo spojené, t.j. kmene izolované z listov paradajok sú menej virulentné ako kmene „zemiakov“ (tabuľka 11).
5) Neutrálne značky. Analýza neutrálnych markerov v populáciách P. infestans parazitujúcich na zemiakoch a rajčiakoch tiež svedčí o viacsmernom vnútrodruhovom výbere. V brazílskych populáciách P. infestans patrili izoláty paradajkových listov do klonálnej línie US-1 a izoláty zo zemiakových listov do línie BR-1 (Suassuna et al., 2004). Na Floride (USA) začal od roku 1994 dominovať klon US-90 na zemiakoch (s výskytom viac ako 8%) a klony US-11 a US-17 na rajčiakoch. Tieto izoláty sú agresívnejšie pre paradajky ako pre zemiaky (Weingartner , Tombolato, 2004). Významné rozdiely vo frekvenciách genotypov (odtlačky prstov DNA) v izolátoch zemiakov a paradajok boli stanovené pre 1200 kmeňov P. infestans odobratých v Spojených štátoch od roku 1989 do roku 1995 (Deahl a kol., 1995).
Použitím metódy AFLP bolo možné separovať 74 kmeňov zozbieraných z listov zemiakov a paradajok v rokoch 1996-1997. vo Francúzsku a Švajčiarsku, v 7 skupinách. Kmene zemiakov a paradajok sa zreteľne nelíšili, ale „zemiakové“ kmene boli geneticky rozmanitejšie ako tie „paradajkové“. Prvé sa našli vo všetkých siedmich zhlukoch a druhé iba v štyroch, čo naznačuje ich špecializovanejší genóm (Knapova a Gisi, 2002).
6) Mechanizmy izolácie. Ak sa populácie parazitov na dvoch druhoch hostiteľských rastlín vyvinú smerom k zúženiu špecializácie na ich „vlastného“ hostiteľa, potom vzniknú rôzne pre- a postmeiotické mechanizmy, ktoré bránia vzájomnej populácii genetických výmen (Dyakov a Lekomtseva, 1984).
Niekoľko štúdií skúmalo vplyv zdroja rodičovských kmeňov na účinnosť hybridizácie. Keď sa kmene izolované z rôznych druhov rodu Solanum krížili v Ekvádore (Oliva et al., 2002), zistilo sa, že kmene s typom párenia A2 z divých nočných tieňov (klonálna línia EC-2) sa krížili najhoršie s kmeňmi paradajok (línia EC -3) a najefektívnejšie krížený s kmeňom zemiakov (EC-1).
Zistilo sa, že všetky hybridy nie sú patogénne. Autori sa domnievajú, že nízke percento hybridizácie a zníženie patogenity hybridov je spôsobené postmeiotickými mechanizmami reprodukčnej izolácie populácií.
V experimentoch Bagirova et al. (1998) bolo skrížené veľké množstvo kmeňov zemiakov a paradajok s vlastnosťami rás T0 a T1. Najplodnejšie boli kríženia kmeňov T1xT1 izolovaných z rajčiakov (36 oospór v zornom poli mikroskopu, 44% klíčenia oospór), najmenej účinné boli kríženia rás T0xT1 izolované od rôznych hostiteľov (nízky počet vyvíjajúcich sa a vyklíčených oospór, vysoký podiel neúrodných a málo rozvinutých oporóz) ... Účinnosť kríženia medzi izolátmi rasy T0 izolovanej zo zemiakov bola stredná. Pretože hlavné telo kmeňov rasy T0 ovplyvňuje zemiaky, má spoľahlivý zdroj zimovania - zemiakové hľuzy, v dôsledku čoho je význam oospór ako zimujúcich infekčných jednotiek pre populácie zo zemiakov malý. Upravená „paradajková forma“ je schopná prezimovať na paradajke vo forme oporóp (pozri nižšie), a preto si zachováva vyššiu produktivitu sexuálneho procesu. Vďaka svojej vysokej plodnosti získava T1 nezávislý potenciál pre primárnu infekciu v rajčiakoch. Výsledky získané Knapovou a kol. (Knapova a kol., 2002) možno interpretovať rovnakým spôsobom. Kríže kmeňov izolovaných z zemiakov s kmeňmi paradajok poskytli najvyšší počet oospór - 13,8 na m². médium (s nátierkou 5-19) a stredné percento klíčenia oospór (6,3 s nátierkou 0-24). Krížením kmeňov izolovaných z paradajok sa získalo najnižšie percento oospór (7,6 s rozpätím 4–12) s najvyšším percentom ich klíčenia (10,8). Kríženia medzi kmeňmi izolovanými zo zemiakov poskytli stredný počet oospór (8,6 s vysokým rozptylom údajov - 0-30) a najnižšie percento klíčenia oospór (2,7). Kmene zo zemiakov sú teda menej úrodné ako kmene z paradajok, ale kríženie medzi populáciami neprinieslo horšie výsledky ako intrapopulačné. Je možné, že rozdiely s vyššie uvedenými údajmi Bagirovej a kol. sa vysvetľujú skutočnosťou, že ruskí vedci pracovali s kmeňmi izolovanými na začiatku 90. rokov 90. storočia a švajčiarski vedci - s kmeňmi izolovanými koncom XNUMX. rokov.
Základom pre nízku plodnosť môže byť heteroploidita kmeňov. Ak je v mexických populáciách, kde je pohlavný proces a primárna infekcia potomkami oospór pravidelná, väčšina študovaných kmeňov P. Infestans diploidná, potom je v krajinách Starého sveta pozorovaný intrapopulačný polymorfizmus ploidie (di-, tri- a tetraploidné kmene, ako aj heterokaryotické kmene s heteroploidnými jadrami) a kmene, ktoré majú rôzne typy párenia, t.j. vzájomne plodné, líšia sa nukleárnou ploiditou (Therrien a kol., 1989, 1990; Whittaker a kol., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Rozmanitosť jadier v anterídiách a oogónii môže byť príčinou nízkej plodnosti.
Pokiaľ ide o nukleárne výmeny medzi hýfami počas anastomóz, bráni tomu vegetatívna nekompatibilita, ktorá rozdeľuje nepohlavné populácie na mnoho geneticky izolovaných klonov (Poedinok a Dyakov, 1987; Gorbunova a kol., 1989; Anikina a kol., 1997b).
7) Konvergencia populácií. Vyššie uvedené údaje naznačujú, že je možná hybridizácia medzi kmeňmi „zemiakov“ a „paradajok“ P. infestans. Je tiež možná vzájomná opätovná infekcia rôznych hostiteľov, aj keď so zníženou agresivitou.
Štúdia populačných markerov na izolátoch zo susedných zemiakových a paradajkových polí v roku 1993 ukázala, že asi štvrtina izolátov izolovaných z listov paradajok bola prenesená zo susedného zemiakového poľa (Dolgova et al., 1997). Teoreticky by sa dalo predpokladať, že by sa divergencia populácií na dvoch hostiteľoch zvýšila a viedla k vzniku špecializovaných vnútrodruhových foriem (napr. Zemiaky a paradajky), najmä preto, že oospory môžu pretrvávať v rastlinných zvyškoch (Drenth et al., 1995). ; Bagirova, Dyakov, 1998) a semená rajčiaka (Rubin et al., 2001). V dôsledku toho majú rajčiaky v súčasnosti zdroj jarnej regenerácie nezávisle od zemiakových hľúz.
Všetko sa však stalo inak. Prezimovanie oospórami umožnilo parazitovi vyhnúť sa najužšiemu stupňu jeho životného cyklu - monocyklickému stupňu vegetácie v pôde, počas ktorého sa znižujú parazitické vlastnosti, ktoré sa v lete postupne obnovujú v polycyklickej fáze.
Tabuľka 11. Frekvencie génov virulencie na odrody diferenciačných zemiakov v kmeňoch P. infestans
Krajiny | Rok | Priemerný počet génov virulencie v kmeňoch | Autor | |
zo zemiakov | z paradajok | |||
Francúzsko | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton a kol., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francúzsko, Švajčiarsko | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapová, Gisi, 2002 |
Spojené štáty americké | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin a kol., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance a kol., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekvádor | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun a kol., 1998 |
Izrael | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusko, Mosk. regiónu | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusko, rôzne regióny | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya a ďalší. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primárne zoosporangie a zoospóry, ktoré klíčia oospóry, majú vysoký stupeň parazitickej aktivity, najmä ak sa oospóry vytvorili partenogeneticky pod vplyvom feromónov kmeňa s opačným typom párenia. Preto je infekčný materiál na sadeniciach rajčiakov vypestovaných zo semien infikovaných oospórami vysoko patogénny pre paradajky aj pre zemiaky.
Tieto zmeny viedli k ďalšej reštrukturalizácii obyvateľstva, ktorá je vyjadrená v nasledujúcich dôležitých zmenách z epidemiologického hľadiska:
- Napadnuté sadenice paradajok sa stali dôležitým zdrojom primárnej infekcie zemiakov (Filippov, Ivanyuk, osobné správy).
- Epifytózy na zemiakoch sa začali pozorovať už v júni, asi o mesiac skôr ako zvyčajne.
- V sadení zemiakov sa zvýšilo percento rasy T1, s ktorou sa tu predtým stretlo v nevýznamnom množstve (Ulanova et al., 2003).
- Kmene izolované z listov rajčiaka sa už nelíšili od kmeňov zemiakov virulenciou na zemiakových diferenciátoroch génov virulencie a začali agresívne prekonávať „zemiakové“ kmene nielen na rajčiakoch, ale aj na zemiakoch (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Namiesto divergencie teda došlo ku konvergencii populácií, k vzniku jedinej populácie na dvoch hostiteľských rastlinách s vysokou virulenciou a agresivitou pre oba druhy.
Záver
Aj napriek viac ako 150 rokom intenzívneho štúdia P. infestans v biológii, vrátane populačnej biológie tohto pôvodcu najdôležitejších chorôb kultivovaných rastlín soleana, zostáva veľa neznámych. Nie je jasné, ako prechod jednotlivých etáp životného cyklu ovplyvňuje štruktúru populácií, aké sú genetické mechanizmy kanalizovanej variability agresivity a virulencie, aký je pomer reprodukčného a klonálneho systému reprodukcie v prírodných populáciách, ako sa dedí vegetatívna nekompatibilita, aká je úloha zemiakov a paradajok pri primárnej infekcii týchto plodín a pri aký je ich vplyv na štruktúru populácií parazitov. Doteraz neboli vyriešené také dôležité praktické problémy, ako sú genetické mechanizmy na zmenu agresivity parazita alebo erózia nešpecifickej rezistencie zemiakov. S prehlbovaním a rozširovaním výskumu o plesni zemiakovej predstavuje parazit pre výskumníkov nové výzvy. Avšak zlepšenie experimentálnych schopností, vznik nových metodických prístupov k manipulácii s génmi a proteínmi nám umožňujú dúfať v úspešné riešenie nastolených otázok.
Článok bol publikovaný v časopise „Potato Protection“ (č. 3, 2017)