D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinová, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fytopatogénna huba Colletotrichum coccodes spôsobuje nebezpečné zemiaky a paradajky známe ako antraknóza a čierna škvrna hľuzy. Podľa morfologických charakteristík je často ťažké ich odlíšiť od chorôb spôsobených inými mikroorganizmami; na plodoch zelených paradajok môže byť choroba bezpríznaková, prejavujúca sa iba na zrelých červených plodoch. Pre rýchlu a presnú diagnostiku patogénu sa ponúka systém testovania PCR v reálnom čase. Na vyvinutie testovacieho systému bola stanovená nukleotidová sekvencia génu pre glycerol trifosfát dehydrogenázu 45 C. kódujúcich kmeňov izolovaných z hľúz zemiakov v rôznych oblastiach Ruska.
Na základe získaných výsledkov a analýzy podobných sekvencií iných druhov dostupných v databáze GenBank boli navrhnuté druhovo špecifické priméry a sonda pre C. coccodes. Na overenie špecifickosti vytvoreného testovacieho systému sa uskutočnila PCR s DNA izolovanou z čistých kultúr 15 rôznych druhov parazitických a saprotrofných húb spojených s rastlinami paradajok a zemiakov (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prítomnosť kódovacích kódov Colletotrichum bola stanovená pri prahovom cykle 20–27, zatiaľ čo iné druhy boli detekované po 40 cykloch alebo neboli detekované. Testovací systém umožňuje spoľahlivo detegovať koncentrácie C. coccodes DNA v analyzovanej zmesi PCR nad 0.01 ng / mm3. Použitím vyvinutého testovacieho systému sa zisťovala prítomnosť C. coccodes v listoch rajčiaka s príznakmi plesňových chorôb a v zemiakových hľuzách bez vonkajších príznakov choroby. Listy s príznakmi plesňovej infekcie sa zbierali z dvoch rôznych polí na Krasnodarskom území, hľúz - z polí v regiónoch Kostroma, Moskva, Kaluga a Nižný Novgorod. Jeden list rajčiaka obsahujúci DNA kódujúci C. cocdes bol nájdený na území Krasnodar; významná prítomnosť DNA tohto patogénu bola zistená v 5 vzorkách hľúz pestovaných v regiónoch Kostroma, Moskva a Kaluga.
Úvod
Huby rodu Colletotrichum sú nebezpečné fytopatogény ovplyvňujúce obilniny, zeleninu, byliny, viacročné ovocie a bobule. Jeden zo všadeprítomných druhov tohto rodu, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, je pôvodcom antraknózy a čiernej škvrny zemiakov a paradajok a spôsobuje choroby radu ďalších rastlín čeľade Solanaceae, vč. buriny (Dillard, 1992). C. coccodes infikuje všetky podzemné časti rastliny, stonky, listy a plody (Andrivon a kol., 1998; Johnson, 1994). Na šupke infikovaných zemiakových hľúz sa pozoruje vývoj sivých škvŕn s nevýrazne výraznými okrajmi, na ktorých sú zreteľne viditeľné čierne bodky sporulácie a mikrosklerócií. Počas skladovania sa v buničine hľúz môžu tvoriť vredy so zmäkčeným obsahom, t.j. choroba vstupuje do antraknózovej fázy, ktorá je však mimoriadne zriedkavá.
Zároveň sú pre ovocie rajčiaka typické príznaky antraknózy (kožné vredy s malými čiernymi bodkami). Na listoch sa príznaky C. coccodes javia ako tmavohnedé škvrny, zvyčajne ohraničené žltým tkanivom (Johnson, 1994).
Vznik čiernej škvrny na hľuzách kazí ich vzhľad, čo je obzvlášť výrazné pri predaji umytých zemiakov s červenými šupkami. Peelingová exfoliácia vedie k nadmernému odparovaniu a zvýšeným stratám pri skladovaní (Hunger, McIntyre, 1979). Poškodenie iných rastlinných orgánov vedie k strate výnosu, ktorá sa zaznamenala na otvorenej aj uzavretej pôde (Johnson, 1994; Tsror a kol., 1999). Choroby spôsobené kódovaním C. sú bežné takmer vo všetkých regiónoch sveta, ktoré produkujú zemiaky, vrátane Ruska (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrola týchto chorôb je zložitá z dôvodu nedostatočnej účinnosti existujúcich fungicídov proti C. coccodes a nedostatku rezistentných odrôd (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inoculum môže pretrvávať v hľuzách semien (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), semenách paradajok (Ben-Daniel et al., 2010), prežiť dlho v pôde, na rastlinných zvyškoch (Dillard, 1990) ; Dillard, Cobb, 1993) a na burinách (Raid, Pennypacker, 1987). Práce mnohých autorov (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) ukázali, že vývoj choroby u zemiakov a paradajok do značnej miery závisí od prítomnosti inokula v semene a pôda. Preto, aby sa minimalizovali straty z choroby, je potrebné diagnostikovať (vrátane kvantitatívneho) množenie húb v semennom materiáli, v pôde, v hľuzách zemiakov a semenách rajčiakov určených na uskladnenie. Morfologickú diagnostiku v pôde a rastlinnom materiáli je možné vykonať iba za prítomnosti mikrosklerócií, ktoré sa však vyskytujú aj v iných druhoch húb.
Príznaky na hľuzách sú veľmi podobné striebristému chrastavitosti spôsobenej hubou Helminthosporium solani. Izolácia kodónov Colletotrichum a Helminthosporium solani do čistej kultúry je dosť náročná a trvá dlho kvôli pomalému rastu na živnom médiu. Na rýchlu identifikáciu kódov Colletotrichum je potrebné použiť inštrumentálne diagnostické metódy. Najvýhodnejšou metódou je polymerázová reťazová reakcia (PCR) a jej modifikácia - real-time PCR. V súčasnosti sa v Európe a Spojených štátoch používa testovací systém vyvinutý britskými výskumníkmi (Cullen a kol., 2002) pre oblasť ITS1 rDNA. Jeho použitie ukázalo dobré výsledky v analýze ruských izolátov (Belov et al, 2018). Avšak C. cococodes je veľmi variabilný a jeho detekcia z jednej sekvencie DNA môže viesť k falošne negatívnym výsledkom. Pre spoľahlivejšiu diagnózu je potrebná analýza niekoľkých druhovo špecifických sekvencií DNA, v súvislosti s ktorými sme vyvinuli originálny testovací systém, ktorý umožňuje identifikáciu kódov C. podľa sekvencie génu pre glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu.
Materiály a metódy
Na posúdenie účinnosti a špecifickosti vytvorených testovacích systémov sme použili čisté kultúry 15 druhov húb, ktoré autori izolovali z chorých vzoriek listov a plodov paradajok, zemiakových hľúz (tabuľka 1). Na izoláciu sa odobrali orgány rastlín s príznakmi plesňovej infekcie, najviac jeden orgán na jeden krík.
Plátok hľuzy so šupkou, plátok paradajkového ovocia a postihnutý list sa umiestnili pod binokulárny mikroskop, potom sa mycélium, spóry alebo kúsok tkaniva prenieslo na agarové médium (mladinový agar) do Petriho misky s nabrúsenou disekčnou ihlou. Izoláty sa skladovali na agare šikmo v skúmavkách pri 4 ° C.
Vzorky listov rajčiaka s príznakmi plesňových chorôb určené na analýzu, ihneď po odbere (v teréne), sa umiestnili do 70% etylalkoholu, v ktorom sa skladovali až do izolácie DNA. Zemiakové hľuzy boli dodané do laboratória, vylúpané z nich (kus 2 × 1 cm) a zmrazené na –20 ° С. Skladované zmrazené až do izolácie DNA.
Čisté kultúry húb na izoláciu DNA sa pestovali v kvapalnom hrachovom médiu. Mycélium huby bolo odstránené z kvapalného média, vysušené na filtračnom papieri, zmrazené v kvapalnom dusíku, homogenizované, inkubované v pufri CTAB, prečistené chloroformom, vyzrážané zmesou izopropanolu a 0.5 M octanu draselného a dvakrát premyté 2% alkoholom. Výsledná DNA sa rozpustila v deionizovanej vode a uskladnila sa pri teplote –70 ° C (Kutuzova et al., 20). Koncentrácia DNA sa merala pomocou súpravy na kvantifikáciu HS DNA pre dvojvláknovú DNA na Qubit 2017 (Qiagen, Nemecko). Alkoholizované a zmrazené vzorky sa triturovali v kvapalnom dusíku a potom sa uskutočnila extrakcia DNA, ako je opísané vyššie (pre mycélium čistých plesňových kultúr).
Tabuľka 1. Pôvod použitých kmeňov húb
Názov huby | Rastlina, orgán | Miesto výberu |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | zemiakové hľuzy | Región Kostroma, hľuzy zemiakov 1. poľnej generácie, kultivar Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | zemiakový list | Rep. Mari El, Joškar-Ola |
Helminthosporium solani | zemiakové hľuzy | Magadanská oblasť, poz. Stan, zemiaková hľuza |
Cladosporium fulvum | paradajkový list | Moskovská oblasť, veľkoplodá paradajka |
Alternaria tomatophila | paradajkové ovocie | predložené pracovníkmi laboratória mykológie a fytopatológie Všeruského výskumného ústavu ochrany rastlín |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | paradajkové ovocie | Krasnodarské územie, okres Krymsky, platová trieda Cream |
Fusarium oxysporum | koreň pšenice | Regiónu Moskva |
PCR sa uskutočňovala na zosilňovači DTprime (DNA-Technology). Pre PCR sa použili pôvodné priméry a sonda pre druhovo špecifickú oblasť génu pre glycerol trifosfát dehydrogenázu: priamy primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reverzný primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Priméry amplifikujú oblasť 213 bp.
Reakcia trvala 50 ng celkovej DNA (pri analýze listov a hľúz) a 10 ng (pri analýze DNA čistých kultúr húb). Reakčná zmes (35 μl) sa rozdelila parafínovou vrstvou na dve časti: dolná (20 μl) obsahovala 2 μl 10x reakčného pufra (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM každého deoxynukleotid trifosfátu, 7 pmol každého priméru a 4 pmol hydrolyzovateľnej fluorescenčnej sondy; horný obsahoval 1 μl 10 x PCR pufru a 1 U Taq polymerázy.
Oddelenie zmesi parafínom umožňuje, aby sa skúmavky dlho skladovali pri teplote 5 ° C a aby sa zabezpečil horúci štart pre PCR po ich 10-minútovom zahrievaní na teplotu nad 80 ° C. PCR sa uskutočňovala podľa nasledujúceho programu: 94.0 ° C - 90 s (1 cyklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cyklov); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cyklov); 10.0 ° C - skladovanie.
Výsledky a diskusia
Sekvencie génu pre glycerol trifosfát dehydrogenázu sa stanovili u 45 kmeňov izolovaných z listov, stoniek, hľúz zemiakov a plodov rajčiaka (Kutuzova, 2018) v rôznych regiónoch Ruska. Skúmané sekvencie všetkých kmeňov boli rozdelené do 2 skupín líšiacich sa dvoma nukleotidmi. Nukleotidové sekvencie predstaviteľov oboch skupín pod číslami KY496634 a KY496635 sú uložené v GenBank.
Priméry coc70gdf, coc280gdr a sonda cocgdz navrhnuté na ich základe boli skontrolované pomocou programu BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) na všetky sekvencie génu pre glycerol trifosfát dehydrogenázu druhov rodu Colletotrichum a iných organizmov dostupných v databáze GenBank.
Nenašli sa žiadne oblasti DNA iných organizmov vysoko homológnych s primermi a sondou.
Citlivosť testovacieho systému sa kontrolovala pomocou vzoriek s rôznymi koncentráciami DNA kódujúcich C. cod, DNA listu zemiakov infikovaných antraknózou (zhromaždené v roku 2017 v Mari El, odroda Red Scarlett) a šupky hľúz ovplyvnené čiernou škvrnou (zhromaždené v oblasti Kostroma, odroda Red Scarlett, tabuľka 2). Na potvrdenie prítomnosti DNA v hľuzách a listoch zemiakov sa z nich izolovali kmene C. coccodes do čistých kultúr.
Výsledky analýzy citlivosti testovacieho systému ukazujú, že je možné ho použiť na úspešnú diagnostiku prítomnosti DNA kodekov C. vo vzorke, ak je jej celkový obsah v zmesi PCR viac ako 0.05 ng. To je na detekciu úplne postačujúce, pretože jedna sklerócia obsahuje v priemere 0.131 ng a jedna spóra obsahuje asi 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Testovací systém vyvinutý anglickou skupinou (Cullen et al., 2002) vykazoval podobnú citlivosť (prahový cyklus 34 pri 0.05 ng DNA a 37 pri 0.005 ng).
Analýza prírodných vzoriek obsahujúcich C. kódovanie vo všetkých prípadoch umožnila spoľahlivo odhaliť jeho prítomnosť vo vzorke (tabuľka 2). Navrhovaná metóda izolácie DNA bola použiteľná aj na analýzu vzoriek prírodných rastlín.
Tabuľka 2. Stanovenie citlivosti navrhovaného testovacieho systému na identifikáciu kódov Colletotrichum pre PCR v reálnom čase
vzorka | Množstvo DNA vo vzorke *, ng | Prahový cyklus | C. detekcia kódov |
---|---|---|---|
Kóduje Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kôra hľuzy 1 | 50 | 32 | + |
Kôra hľuzy 2 | 50 | 30 | + |
Kôra hľuzy 3 | 50 | 31.5 | + |
List zemiakov | 50 | 29.5 | + |
Poznámka. * V zmesi produktov PCR.
Špecifickosť testovacieho systému sa testovala na vzorkách DNA extrahovaných z 15 druhov húb. Autori izolovali všetky kmene húb z postihnutých a zdravých plodov a listov paradajok, hľúz zemiakov; jeden kmeň bol izolovaný z koreňa pšenice (tabuľka 1). Medzi druhmi izolovanými z povrchu ovocia sa vyskytujú aj druhy, ktoré nie sú pre paradajky patogénne (napríklad Phellinus ferrugineovelutinus).
Štúdie preukázali, že DNA kódujúca kód C. bola detegovaná pri prahovom cykle 20–27, zatiaľ čo iné druhy húb neboli detegované alebo poskytli signál po 40. cykle, čo možno pripísať nešpecifickému šumovému efektu (tabuľka 3).
Tabuľka 3. Kontrola testovacieho systému na rôzne druhy húb
Názov huby | Prahový cyklus |
Colletotrichum kóduje 1 | 20.9 |
C. kódovanie 2 | 22.6 |
C. kódovanie 3 | 23 |
C. kódovanie 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodoncium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Poznámka. * Množstvo DNA vo všetkých vzorkách bolo 10 ng.
Vyvinutý testovací systém bol použitý na identifikáciu C. coccodes vo vzorkách listov rajčiaka s príznakmi nekrotrofných patogénov a hľuzami zemiakových semien bez viditeľných príznakov. Pre štúdiu sme zobrali hľuzy semien rôznych odrôd pestovaných v regiónoch Kostroma, Moskva, Kaluga, Nižný Novgorod. Prítomnosť DNA kódujúca C. bola považovaná za významnú vo vzorkách, pri analýzach ktorých prahový cyklus nepresiahol 35. Táto prahová hodnota bola vybraná na základe spoľahlivého stanovenia 0.05 ng DNA C. coccodes (prahový cyklus 33.5, tabuľka 2) a skutočnosti, prahové cykly nad 40, bola diagnostikovaná nešpecifická DNA niektorých iných druhov húb. Týmto prístupom sa zistila významná prítomnosť DNA kódujúcich C. v 5 vzorkách hľúz pestovaných v regiónoch Kostroma, Moskva, Kaluga a v jednom liste rajčiaka z okresu Yeisk v regióne Krasnodar (tabuľky 4, 5).
Tabuľka 4. Detekcia kódov Colletotrichum na hľuzách zemiakov *
Číslo vzorky | Rozmanitosť zemiakov | Miesto rastu | C. detekcia kódov | Prahový cyklus |
---|---|---|---|---|
1 | Červená šarlátová | Región Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Regiónu Moskva | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovský skoro | Regiónu Moskva | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga region. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantázie | Kaluga region. | - | |
15 | slávnosť | Nižnij Novgorod región. | - | |
16 | - |
Poznámka. * Množstvo DNA vo všetkých vzorkách bolo 50 ng.
Tabuľka 5. Detekcia kódov Colletotrichum na listoch rajčiaka *
Číslo vzorky | Miesto rastu | C. detekcia kódov | Prahový cyklus |
---|---|---|---|
1 | Krasnodarské územie, Krymský okres | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodarské územie, okres Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Množstvo DNA vo všetkých vzorkách bolo 50 ng.
Nami vyvinutý testovací systém nie je v citlivosti a špecifickosti horší ako systém vyvinutý britskými vedcami (Cullen et al., 2002) a je vhodný na analýzu vzoriek rastlín. Jeho aplikácia na analýzu semenných hľúz umožnila identifikovať DNA C. coccodes v hľuzách bez vonkajších známok poškodenia a úspešne analyzovať infekciu listov.
V Rusku sa doposiaľ neuskutočnila žiadna analýza zemiakových hľúz na napadnutie C. coccodes. Naša prvá štúdia ukázala, že zo 16 testovaných hľúz osiva pestovaných v rôznych regiónoch Ruskej federácie obsahuje 5 C. coccodes. To ukazuje, že čierna škvrna zemiakových hľúz je v Rusku bežnou chorobou zemiakov a jej úloha pri znižovaní objemu a kvality úrody zemiakov je podceňovaná.
Analýza listov rajčiaka odhalila významnú prítomnosť DNA kódujúcich C. v jednom liste z okresu Yeisk na Krasnodarskom území. Predtým sa pri skúmaní paradajkových polí v južnom Rusku pomocou britského testovacieho systému (Cullen et al., 2002) našli listy obsahujúce C. coccodes a v niektorých poliach sa zistil vysoký podiel listov infikovaných C. coccodes (Belov et al., 2018). Na územiach Krasnodar a Primorsky v Moskovskej oblasti sme našli plody paradajok, z ktorých sa nám podarilo izolovať čisté kultúry C. coccodes. Je možné, že kódovanie C. coccodes je na rajčiakoch v Rusku oveľa rozšírenejšie, ako sa v súčasnosti predpokladá, a jeho škodlivosť sa tiež podceňuje.
K dnešnému dňu sa teda nazhromaždilo dostatok informácií o rozšírenej distribúcii C. coccodes na zemiakoch a paradajkach.
Aby sme lepšie pochopili úlohu tejto huby pri vývoji chorôb zemiakov a paradajok, je potrebné sledovať jej prevalenciu v Rusku, študovať úlohu infekcií pôdy a semien a úlohu čiernej škvrny pri stratách počas skladovania. Túto prácu môže výrazne uľahčiť použitie diagnostiky PCR a súčasné použitie oboch testovacích systémov významne zvýši presnosť analýzy.
Táto práca bola podporená grantom Ruskej vedeckej nadácie č. 18-76-00009.
Článok bol publikovaný v časopise „Mycology and Phytopathology“ (ročník 54, č. 1, 2020).