JESŤ. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elanský
Nedávno sa ukázalo, že huba Ilyonectria crassa je schopná infikovať hľuzy zemiakov. V tejto práci sa prvýkrát analyzujú biologické vlastnosti a odolnosť voči niektorým fungicídom kmeňa I. crassa izolovaného zo zemiakov. Sekvencie druhovo špecifických oblastí kmeňa „zemiaka“ sa zhodovali so sekvenciami získanými skôr pre huby izolované z koreňov narcisu, ženšenu, osiky a buka, cibúľ ľalie a listov tulipánov. Zdá sa, že rezervami I. crassa môžu byť mnohé divoké a záhradné rastliny. Skúmaný kmeň infikoval plátky paradajok a zemiakov, ale neinfikoval celý plod paradajky a neporušenú zemiakovú hľuzu. To ukazuje, že I. crassa je ranový parazit. Hodnotenie rezistencie na fludioxonil, difenokonazol a azoxystrobín na živnom médiu ukázalo vysokú účinnosť týchto liekov.
Indikátor EC50 (koncentrácia fungicídu, ktorá spomaľuje 2-násobok rýchlosti radiálneho rastu kolónie v porovnaní s kontrolou bez fungicídu) sa rovnala 0.4; 7.4 a 4 mg/l. Možnosť rozvoja choroby spôsobenej I. crassa by sa mala brať do úvahy pri fytopatologickom hodnotení hľúz zemiakov a vypracúvaní opatrení na ochranu rastlín.
Rozvoj fytopatogénnych mikroorganizmov vedie k vysokým stratám vo všetkých fázach pestovania a skladovania zemiakov. Pri plánovaní ochranných opatrení sa spravidla prihliada na známe patogény, ako sú druhy rodov Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora atď. V posledných rokoch sa však objavuje stále viac správ. o výskyte nových fytopatogénnych mikroorganizmov na zemiakoch. Ich biológia je nedostatočne študovaná, účinnosť fungicídov používaných na zemiaky vo vzťahu k nim nie je známa, diagnostické metódy neboli vyvinuté. S masívnym vývojom sú schopné spôsobiť značné škody na úrode zemiakov. Jedným z týchto mikroorganizmov je askomycétová huba Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, ktorú autori prvýkrát objavili na hľuzách zemiakov (Chudinova et al., 2019).
Táto práca prezentuje výsledky analýzy kmeňa I. crassa izolovaného z hľúz zemiakov. Študovala sa morfológia kolónií a mycéliové štruktúry I. crassa, nukleotidové sekvencie druhovo špecifických oblastí DNA, virulencia na zemiaky a paradajky a rezistencia na niektoré populárne fungicídy.
Materiály a metódy
Použili sme kmeň I. crassa 18KSuPT2 izolovaný v roku 2018 z infikovanej zemiakovej hľuzy pestovanej v oblasti Kostroma. Hľuza bola napadnutá suchou hnilobou s dutinou pokrytou svetlohnedým mycéliom. Pomocou sterilnej pitevnej ihly sa mycélium húb prenieslo do Petriho misky s agarovým médiom (pivná mladina 10 %, agar 1.5 %, penicilín 1000 U/ml). Platne sa inkubovali v tme pri 24 °C.
Na fotografovanie, hodnotenie veľkosti a morfológie spór a orgánov spór bol použitý svetelný mikroskop Leica DM2500 s digitálnou kamerou ICC50 HD a binokulárny mikroskop Leica M80 s digitálnou kamerou IC80HD (Leica Microsystems, Nemecko).
Na izoláciu DNA sa mycélium húb pestovalo v tekutom hrachu, potom sa zmrazilo v tekutom dusíku, homogenizovalo, inkubovalo sa v CTAB pufri, čistilo sa chloroformom a dvakrát sa premylo 2 % alkoholom.
Metóda extrakcie DNA je podrobne opísaná v článku Kutuzova et al. (2017).
Na určenie druhov molekulárnymi metódami a porovnanie s inými známymi kmeňmi I. crassa sa uskutočnila PCR s primérmi umožňujúcimi amplifikáciu druhovo špecifických oblastí DNA: ITS1-5,8S-ITS2 (priméry ITS5 / ITS4, White et al., 1990), génové oblasti b-tubulín (Bt2a/Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) a translačný elongačný faktor 1α (teflα) (priméry EF1-1F/EF728-1R, Carbone a Kohn, 986). Amplikóny požadovanej dĺžky boli extrahované z gélu pomocou súpravy Evrogen CleanUp. Amplifikované oblasti sa sekvenovali pomocou súpravy BigDye® Terminator v1999 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) na automatickom sekvenátore Applied Biosystems 3.1 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Výsledné nukleotidové sekvencie sa použili na hľadanie zhody v databáze GenBank amerického Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI). Fylogenetická analýza bola vykonaná pomocou programu MEGA 3730 (Tamura et al., 6).
Stanovenie virulencie sa uskutočnilo na celých zelených plodoch veľkoplodej paradajky (odroda Dubrava) a hľúz zemiakov (odroda Gala). Okrem toho sme na simuláciu poškodenia poškodených plodov a hľúz použili plátky rovnakých plodov a hľúz. Plátky hľúz sa umiestnili do vlhkých komôr, ktorými boli Petriho misky s vlhkým filtračným papierom na dne. Na papier sa položilo podložné sklíčko, na ktoré sa zasa ukladali plátky hľúz alebo ovocia. Celé hľuzy a plody sa tiež umiestnili do nádob s mokrým filtračným papierom na dne. Do stredu rezu (alebo na neporušený povrch hľuzy alebo plodu) sa po 5 dňoch pestovania na mladinovom agare umiestnil kúsok agaru (5 × 5 mm) s hubovými hýfami.
Hodnotenie odolnosti kmeňov húb voči fungicídom sa uskutočnilo v laboratórnych podmienkach na agarovom živnom médiu. Študovali sme citlivosť na fungicídne liečivá Maxim, KS (účinná látka fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Štátny katalóg ..., 2020 ). Hodnotenie sa uskutočnilo v Petriho miskách na mladinovom agarovom médiu s prídavkom študovaných liečiv v koncentráciách účinnej látky 0.1; 1; 10 ppm (mg/l) (pre fludioxonil a difenokonazol), 1; desať; 10 ppm (pre azoxystrobín) a v médiách bez fungicídu (kontrola). Fungicíd sa pridal do média, ktoré sa roztopilo a ochladilo na 100 °C, a potom sa médium nalialo do Petriho misiek. Agarový blok s mycéliom húb bol umiestnený do stredu Petriho misky a kultivovaný pri 60 °C v tme. Po 24 dňoch inkubácie sa merali priemery kolónií v dvoch vzájomne kolmých smeroch; výsledky merania pre každú kolóniu boli spriemerované. Experimenty sa uskutočňovali trojmo. Na základe výsledkov analýz sa vypočítala EC7 rovnajúca sa koncentrácii fungicídu, ktorá znížila rýchlosť radiálneho rastu kolónie na polovicu v porovnaní s kontrolou bez fungicídu.
Výsledky a diskusia
Na Petriho miskách s mladinovým agarom huba vytvorila kolónie s bielym vločkovitým mycéliom. Médium pod mycéliom sa zmenilo na červenohnedé. Keď médium vyschne, huba vytvorila spóry dvoch typov na jednotlivých a agregovaných konídiofóroch v malých sporodochiách. Makrokonídie sú predĺžené, valcovité, s jednou až tromi prepážkami, priemerná dĺžka 27.2 µm s rozsahom hodnôt od 23.2 do 32.2 µm, šírka - do 4.9 µm (obr. 1). Priemerná dĺžka mikrokonídií je 14.3 µm s rozsahom hodnôt od 10.3 do 18.1 µm, šírka do 4.0 µm. Všetky makro- a mikromorfologické znaky zapadajú do rozsahu variácie druhu Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekvencie druhovo špecifických oblastí DNA (ITS, b-tubulín, TEF 1α) sa úplne zhodovali so sekvenciami kmeňov I. crassa, ktoré sme študovali skôr (Chudinova et al., 2019, tabuľka 1). Aby bolo možné študovať prevalenciu I. crassa v iných oblastiach a analyzovať spektrum postihnutých kultúr, analyzovali sa podobné sekvencie DNA v databáze GenBank (tabuľka 1). Prekrytie bolo 86 až 100 %. Sekvencie všetkých troch oblastí DNA kmeňa „zemiaka“ I. crassa boli identické so sekvenciami kmeňov izolovaných z cibule ľalie a koreňov narcisov v Holandsku a z koreňa ženšenu v Kanade. Neboli sme schopní nájsť iné kmene I. crassa s tromi analyzovanými analogickými sekvenciami v otvorených databázach. Analýza uložených sekvencií ITS a b-tubulínu však ukázala prítomnosť I. crassa na listoch tulipánov v Spojenom kráľovstve. Huby s podobnou sekvenciou ITS boli identifikované pri analýze mykobioty koreňov osiky v Kanade a koreňov buka v Taliansku a hľúz zemiakov v Saudskej Arábii (tabuľka 1). Výsledky tejto štúdie ukazujú, že I. crassa má globálne rozšírenie a je schopná infikovať rôzne druhy rastlín.
Pri stanovení patogenity na plátkoch paradajky a zemiaku na 5. deň priemer lézie dosiahol 1.5 cm, v tomto prípade skúmaný kmeň neinfikoval celý plod rajčiaka a neporušenú hľuzu zemiaka. Na paradajke však boli ovplyvnené sepaly. Aby sa vylúčila možnosť kontaminácie, izoloval sa hubový izolát z mycélia vyvinutého na plátku zemiakovej hľuzy do čistej kultúry. Bol úplne identický s rodičovským kmeňom. I. crassa je zrejme ranový parazit.
Predvýsadbové ošetrenie semenných hľúz fungicídmi znižuje vznik chorôb na rastlinách počas vegetácie. Pre výber účinných fungicídov je dôležité posúdiť, ktoré z nich sú účinné proti I. сrassa. Práca študovala rozšírené účinné látky fungicídov - fludioxonil, azoxystrobín, difenokonazol. Fludioxonil je formulovaný v niekoľkých zmesiach používaných na morenie semien a hľúz pred výsadbou. Fludioxonil (Maxim) sa používa aj na ošetrenie semenných hľúz pred skladovaním. Difenokonazol a azoxystrobín sú tiež zahrnuté v množstve prípravkov používaných na spracovanie semenného materiálu, ako aj v prípravkoch určených na spracovanie vegetatívnych rastlín (Štátny katalóg ..., 2020).
Rýchlosť rastu I. crassa bola študovaná na médiách (obr. 2) s rôznymi koncentráciami aktívnych zložiek: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobín (EC50 = 4 ppm) a difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (tabuľka 2 ). Tieto prípravky možno považovať za vysoko účinné proti I. crassa, pretože ich EC50 je výrazne nižšia ako odporúčaná koncentrácia prípravku v pracovnej tekutine používanej na ošetrenie hľúz. Podľa Štátneho katalógu ... (2020) je koncentrácia fludioxonilu v kvapaline na ošetrenie zemiakových hľúz od 500 do 1000 ppm, azoxystrobín (v kvapaline na ošetrenie dna brázdy) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (v kvapaline na ošetrenie vegetatívnych rastlín) - 187.5 – 625 ppm.
Tabuľka 1. Podobnosť sekvencií druhovo špecifických sekvencií kmeňa 18KSuPT2 a kmeňov Ilyonectria crassa dostupných v databáze Genbank
Kmeň | Hostiteľská rastlina, miesto vylučovania | Sekvenčné čísla uložené v GenBank, percento podobností | Odkaz | ||
IDS | β-tubulín | TEF 1a | |||
17KSPT1 a 18KSuPT2 | Zemiaková hľuza, región Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova a kol., 2019, táto práca |
CBS 158/31 | Korene narcisu, Holandsko | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral a kol., 2012 |
CBS 139/30 | Žiarovka ľalie, Holandsko | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Koreň ženšenu, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735/725 99.6 |
|
RHS235138 | List tulipánov, Spojené kráľovstvo | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Korene osiky, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield a kol., 2020 |
ER1937 | Buk, Taliansko | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Priame podanie |
KAUF 19 | Zemiaková hľuza, Saudská Arábia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = neuložené
Tabuľka 2. Rezistencia Ilyonectria crassa voči fungicídom
(účinná látka) | EC50, ppm | ||||
3 deň | 5 deň | 7 deň | |||
Ovládanie | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobín) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
V našej práci boli kmene I. crassa izolované z hľúz zemiakov v Kostromskej a Moskovskej oblasti (Chudinova et al., 2019). Vysoký podiel kmeňov húb s ITS sekvenciami identickými s I. crassa bol odhalený pri analýze mykobioty hľúz zemiakov v Saudskej Arábii (Gashgari a Gherbawy, 2013). I. crassa zjavne nie je na zemiakoch taká vzácna, ako by sa mohlo zdať. V našich pokusoch sa ukázalo, že huba môže infikovať poškodené plody paradajok. Z literatúry je známe, že I. crassa je schopný saprotrofného vývoja v pôde (Moll et al., 2016), ako aj ovplyvňovania rôznych rastlín, aj taxonomicky vzdialených, ako sú narcisy, ľalie, ženšen, osika, a buk (tab. 1).XNUMX). Zdá sa, že rezervami I. crassa môžu byť mnohé divoké a záhradné rastliny. Vyššie uvedené ukazuje, že pri vývoji ochranných opatrení je potrebné vziať do úvahy možnosť ovplyvnenia hľúz zemiakov touto hubou. Rozšírené prípravky na ošetrenie zemiakových hľúz s obsahom fludioxonilu, azoxystrobinu a difenoconazolu preukázali vysokú fungicídnu účinnosť proti I. crassa.
Táto práca bola podporená Ruskou nadáciou pre základný výskum (Grant č. 20-016-00139).
Článok bol publikovaný v časopise "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)